复现原文（二）：Single-cell RNA sequenci

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NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析 （Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析 （ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 （原理、代码和评述）)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step) - Limma差异分析、火山图、功能富集）等内容。

在文章Single-cell RNA sequencing of human kidney中，作者介绍了来自三个人类供体肾脏的23,366个高质量细胞的scRNA-seq数据，并将正常人肾细胞划分为10个clusters。其中，近端肾小管（PT）细胞被分为三个亚型，而集合导管细胞被分为两个亚型。该数据为肾细胞生物学和肾脏疾病的研究提供了可靠的参考。

在本周一的文章（复现原文（一）：Single-cell RNA sequencing of human kidney（step by step））中，我们完成了scRNA-seq数据的质控（Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（三）- 原始数据质控）、批次校正、找Marker基因（单细胞分群后，怎么找到Marker基因定义每一类群？）、UMAP可视化和tSNE可视化（Hemberg-lab单细胞转录组数据分析（十二）- Scater单细胞表达谱tSNE可视化）。本期我们将提取近端肾小管（PT）细胞来完成下面的后续分析。

#Select a subset of PT cells
PT  <- subset(x = kid, idents= c("Proximal convoluted tubule cells","Proximal tubule cells","Proximal straight tubule cells"))
saveRDS(PT,file="PT.rds")

数据准备

加载monocle软件R包：

library(monocle)

monocle输入文件类型有3种类型的格式：

• 表达量文件：exprs基因在所有细胞中的count值矩阵。

• 表型文件：phenoData。

• featureData

3个特征文件转换成CellDataSet格式：

data <- as(as.matrix(PT@assays$RNA@counts), 'sparseMatrix')
pd <- new('AnnotatedDataFrame', data = PT@meta.data)
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))
fd <- new('AnnotatedDataFrame', data = fData)
my_cds <- newCellDataSet(data,
                              phenoData = pd,
                              featureData = fd,
                              lowerDetectionLimit = 0.5,
                              expressionFamily = negbinomial.size())

对monocle对象进行归一化：

my_cds <- estimateSizeFactors(my_cds)
my_cds <- estimateDispersions(my_cds)
my_cds <- detectGenes(my_cds, min_expr = 0.1) ##过滤掉低质量的基因。

查看数据：

head(fData(my_cds))

image.gif

head(pData(my_cds))

image.gif

pData(my_cds)$UMI <- Matrix::colSums(exprs(my_cds))
disp_table <- dispersionTable(my_cds)
head(disp_table)

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在进行降维聚类之前，先获得高表达的基因集作为每个聚类用来order的Feature基因。也可以使用所有的基因，但一些表达量特别低的基因提供的聚类信号往往会制造分析噪音，Feature基因的选择性很多，一种是可以根据基因的平均表达水平来进行筛选，另外我们也可以选择细胞间异常变异的基因。这些基因往往能较好地反映不同细胞的状态（对一篇单细胞RNA综述的评述：细胞和基因质控参数的选择）。

table(disp_table$mean_expression>=0.1)
unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)#细胞平均表达量大于0.1
my_cds <- setOrderingFilter(my_cds, unsup_clustering_genes$gene_id)
plot_ordering_genes(my_cds)

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plot_ordering_genes函数显示了基因表达的变异性（分散性）是如何取决于整个细胞的平均表达的。

expressed_genes <- row.names(subset(fData(my_cds), num_cells_expressed >= 10)) #细胞表达个数大于10
my_cds_subset <- my_cds[expressed_genes, ]
my_cds_subset
head(pData(my_cds_subset))
my_cds_subset <- detectGenes(my_cds_subset, min_expr = 0.1)
fData(my_cds_subset)$use_for_ordering <- fData(my_cds_subset)$num_cells_expressed > 0.05 * ncol(my_cds_subset)
table(fData(my_cds_subset)$use_for_ordering)
plot_pc_variance_explained(my_cds_subset, return_all = FALSE)

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下面进行降维与聚类

my_cds_subset <- reduceDimension(my_cds_subset,max_components = 2,norm_method = 'log',num_dim = 10,reduction_method = 'tSNE',verbose = TRUE)
my_cds_subset <- clusterCells(my_cds_subset, verbose = FALSE)
plot_rho_delta(my_cds_subset, rho_threshold = 2, delta_threshold = 10)
my_cds_subset <- clusterCells(my_cds_subset,rho_threshold = 2,delta_threshold = 10,skip_rho_sigma = T,verbose = FALSE)
table(pData(my_cds_subset)$Cluster)
plot_cell_clusters(my_cds_subset)

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从上图可以看出一种聚成9个clusters。（还在用PCA降维？快学学大牛最爱的t-SNE算法吧, 附Python/R代码）

选择定义细胞发展的基因

head(pData(my_cds_subset))
clustering_DEG_genes <- differentialGeneTest(my_cds_subset,fullModelFormulaStr = '~Cluster',cores = 22)
dim(clustering_DEG_genes)

将细胞按照伪时间排序

library(dplyr)
clustering_DEG_genes %>% arrange(qval) %>% head()
my_ordering_genes <- row.names(clustering_DEG_genes)[order(clustering_DEG_genes$qval)][1:1000]
my_cds_subset <- setOrderingFilter(my_cds_subset, ordering_genes = my_ordering_genes)
my_cds_subset <- reduceDimension(my_cds_subset, method = 'DDRTree') #降维
my_cds_subset <- orderCells(my_cds_subset) #将细胞按照伪时间排序

伪时序轨迹按不同方面绘图

注意参数color_by。（NBT|45种单细胞轨迹推断方法比较，110个实际数据集和229个合成数据集）

plot_cell_trajectory(my_cds_subset, color_by = "State")

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plot_cell_trajectory(my_cds_subset, color_by = "RNA_snn_res.0.25")

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结果图

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原文图

这里由于我们在前期分类的时候使用的是相同的参数，作者分为了3个cluster，我们分成了4个cluster，本质没有什么太大的区别。

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结果图

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原文图

head(pData(my_cds_subset))
my_pseudotime_de <- differentialGeneTest(my_cds_subset,fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)",cores = 22)
my_pseudotime_de %>% arrange(qval) %>% head()
my_pseudotime_de %>% arrange(qval) %>% head() %>% select(gene_short_name) -> my_pseudotime_gene
plot_cell_trajectory(my_cds_subset, color_by = "Pseudotime")

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结果图

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原文图

影响fate decision的gene变化

#"A" stand for top 6 genes of affecting the fate decisions
A=c("AKR1A1","PDZK1","AKR7A3","AKR7A2","FABP3","GADD45A")
my_pseudotime_gene <-A
plot_genes_in_pseudotime(my_cds_subset[my_pseudotime_gene,])

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结果图

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原文图

从上面我得到的图和原文图的比较来看，结果可能存在一定的差异（… image

…），但基本模块是相似的。

整个文章也并没有对以上的伪时序分析进行描述，其最重要的部分应该还是作为人体肾脏单细胞的resource。大家也可以试试呀！

撰文：张虎
校对：生信宝典

参考文献

Liao J, Yu Z, Chen Y, Bao M, Zou C, Zhang H, Liu D, Li T, Zhang Q, Li J, Cheng J, Mo Z. Single-cell RNA sequencing of human kidney. Sci Data. 2020 Jan 2;7(1):4.doi: 10.1038