BBQ(生物信息基础问题34):做RNA-Seq的数据分析逻辑是

  今天的这个BBQ，就是想知道初步的了解一下做RNA-Seq分析的思路。

1. 为什么要做RNA-Seq？

  先来谈谈为什么要做RNA-Seq。假设我们没有RNA-Seq技术，当我们看到经过某1个条件/刺激/处理以后，我们的研究对象，细胞，植株，亦或是可爱的小白鼠有了一些变化。这个时候我们通过观察和实验得到了1个判断：

当对A进行B刺激的时候会出现表型C。

  当有了这个判断以后，正常的推理思路是，表型的出现很大变化------------>可能是由于研究对象的蛋白含量的变化引起的。------>而蛋白的含量最直接的控制就来自于gene表达的变化。

  如果我们能够有办法测量A在进行B刺激以后全部的gene表达变化的gene list D，理应能够得到下一个判断：

当对A进行B刺激的时候会出现表型C，而这个表型C造成的原因很有可能是来自于D这些基因的变化。

  但是这里有个问题，这个刺激需要是一种比较稳定的条件，比如对细胞系进行稳定敲除（knock out）一个gene；再比对用药物持续对植株进行喷洒等等。而不能是，我向细胞盘吐了口唾液，然后立即建库去测RNA-Seq。

  这是因此，我们在推断表型C造成的原因的时候，认为是gene的表达造成的，而从信号响应，到最终的gene表达的变化是需要时间的。因此，刺激以后，过一段时间以后才会出现变化，一般这个时间间隔是以小时为单位计算的。

  当我们认为表型C和刺激B之间是由于gene list D影响的，那么我们就要做RNA-Seq。

2. 为什么能做RNA-Seq？

  那么，我们为什么能做RNA-Seq？貌似是一个很简单的问题，其实不然，这是几十年技术的积累。让RNA-Seq能够走进“寻常百姓家“的原因有很多，能轻而易举想到的：测序费用的降低；基因组的公布/相关物种基因组的公布；分子生物学技术的成熟等等。

  想象一下，如果有一天我们突然不能做RNA-Seq了，那么我们再去想做我们判断的检验就可要1个gene挨着1个gene的去做qRT-PCR了！或者是做价格和准确不不如测序的micro array检测。

3. 拿到数据以后我们应该做点什么？

  核心问题是找到这个gene list D，而这个问题的本质就是去寻找对A进行B刺激前后的差异。那么差异又可以分成几个方向去寻找：

方向1. 表达量的差异；
方向2. 可变剪切的差异；
方向3. 修饰的差异；
方向4. 其他可能存在调控机制的差异

  针对不同的方向去寻找差异，方法也是不同的，比如方向1,2,3的分析方法就有非常大的不同。而选定方向以后，寻找差异的思路又可以扩展开：

1. 差异与whole genome相比是否有一定的分布倾向性？
2. 差异是个例还是具有普遍性？（更换细胞系是否能重复？）
3. 差异与表型是否有统计学相关性？
   ... ...

提问环节：
1：请对本文第3部分方向1,2,3进行举例，比如通过XX条件，对XXX进行了XXX刺激，结果发现有若干gene的表达量发生变化，同时这些gene反映了XXX的生物学功能。需要给出paper的链接。

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27196599
食管鳞状细胞癌（OSCC）是一种侵袭性的恶性肿瘤，本文章通过高通量小分子抑制剂进行筛选，发现了一个高度有效的抗癌物，特异性的CDK7抑制剂THZ1。RNA-Seq显示，低剂量THZ1会对一些致癌基因的产生选择性抑制作用。
这里有一篇分析的文章：https://blog.csdn.net/qq_29300341/article/details/74134083

2：除了上述3个方向，你能否再举出其他可以用RNA-Seq数据进行探索的方向呢？
1：可以通过在RNA-seq数据中发现新的转录物来检测癌症样品中的融合基因或畸变
2：基因表达偏好性
3： 在细胞分化期间基因同种型转换（ isoform switching ）。
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2010-11-12-220

Ref:
1:生物信息学100个基础问题 —— 第34题 做RNA-Seq的数据分析逻辑是怎样的？
2:https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2010-11-12-220
3：https://zhuanlan.zhihu.com/p/35963847
4：https://blog.csdn.net/qq_29300341/article/details/74134083