生信小问:为什么在建库的时候要加A尾?

2018-12-16  本文已影响257人  liu_ll

illunima的二代测序前期处理是需要对DNA进行建库,建库的步骤如下:

DNA建库的示意图
图片来自:http://tucf-genomics.tufts.edu/home/faq
1: 首先DNA得先随机打断,序列长度太长会影响测序的效果
2:在DNA打断之后,DNA会有末端不齐的现象,所以需要把末端补平。一般利用的是T4连接酶,可以把黏性末端补充为平末端。
举个例子
某种补齐的平末端的方法
图片来源于 :https://www.cnblogs.com/think-and-do/p/6613719.html
这两种酶厉害了,可以再补齐平末端的时候,在平末端加A碱基。此外,询问过很多做实验的师兄师姐,在利用DNA聚合酶进行末端补齐的时候A碱基确实比较容易加上去。
3:连接adapter和index (adapter是为了和芯片底部的特异性的adapter进行结合,而index是为了在后期建库扩增的时候所必须的)
4:进行DNA PCR为了使DNA的量达到上机的浓度。DNA纯度的要求是260/280在1.8-2.0 浓度>50ng/ul(微量建库的话DNA浓度可以低点)

问题:为什么加A? A-T键的氢键不是比G-C少吗?为什么不加G-C?
思考答案:
1)adapter上带了T碱基头,为了和adapter配对
2)首先加什么碱基是依靠于在DNA聚合酶的特性,因为在补齐平末端的时候A碱基容易被加上,导致很多补齐后的DNA尾部带A碱基。所以是A

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