单细胞文献解读（二）

Litviňuková, M., Talavera-López, C., Maatz, H. et al. Cells of the adult human heart. Nature (2020).
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2797-4

内容提要 ：本文需要一些关于心脏的生理以及解剖学知识，但是这里仅着重介绍本文的“选材”、“方法”、“思路”，对其知识方面不做过多赘述。

分享理由：这是一篇很典型的大规模scRNA-seq的文章，特别之处在于它是对一个完整的“器官”建立了全景图，并且心脏是一个无论从功能还是结构上来讲都高度复杂的器官。如何从生理功能以及器官建成的角度去解读单细胞测序的数据是我非常关注的地方。

研究背景介绍（来自文章摘要以及简介部分）：

1. 本研究的重要性以及必要性：心血管疾病在全球范围内都是造成死亡的主要因素。 对疾病机制和治疗策略的深入了解需要对健康心脏的分子过程有更深入的了解。
2. 背景知识：心脏是一个复杂的器官，由四个形态和
   功能上不同的腔室组成。 脱氧血低压右心房和心室被推进肺部。
   含氧血液进入左心房和心室，从而推动全身压力下的血液通过全身。 腔室的分离通过房间隔和心室间隔建立，血液的单向流动
   由房室和心室动脉瓣膜建立。心脏内在的电生理系统迅速传播
   从窦房结到房室结的电神经冲动，并沿着浦肯野纤维到收缩开始的顶点。 心脏的解剖和功能复杂性要求精密的协调不同种类细胞群体在不同压力，拉力和生物物理条件下的刺激中不断收缩和松弛。
3. 结果：应用单细胞测序、单细胞核测序以及单分子荧光原位杂交鉴定了成人心脏6个解剖学区域的特征。展现了它们的细胞构成异质性以及不同的发育特征。我们定义了心脏脉管系统的复杂性和
   它沿着动静脉轴的变化。 在免疫部分，我们确定
   心脏常驻巨噬细胞，具有炎症和保护性转录的特点。 此外，细胞间相互作用的分析突出显示了不同心房和心室之间的巨噬细胞-成纤维细胞-心肌细胞网络与骨骼肌不同。

成人心脏细胞全景图

a.展示样本处理流程b.男性\女性之间的差异c.UMAP嵌入487,106个细胞和细胞核描述11种心脏细胞类型和标记基因
主要的marker，图片过长未完全截取
b.展示上图中那些经典标志物的表达量，c.这些标志物在单细胞以及细胞核中都适用
多重单分子荧光原位杂交（Multiplexed smFISH staining）展示细胞类型特异的转录谱

主要工作

• 分离单细胞、细胞核、CD45+阳性细胞
• 根据marker genes对细胞进行分群
• 对分群结果进行进一步分析，主要包括各类细胞所占的比例、不同功能区室（例如心房、心室）细胞构成的差别、男性捐献者和女性捐献者心脏的差别。

主要结果以及推论

• 10X Genomics 获得数据集 45,870 cells, 78,023 CD45+ enriched cells and 363,213 nuclei for 11 major cell types
  心房心肌细胞（aCM），心室心肌细胞（vCM），成纤维细胞（FB），内皮细胞（EC），周细胞（PC），平滑肌细胞（SMC），免疫（髓样，Myel；淋巴样，Lym），脂肪细胞（Adip），间皮细胞（Meso）和神经元细胞（NC）
• 心房心室细胞类型及分布不同见Figure 1c
• 心室中vCM和FB的比例呈负相关，而PC和SMC的比例呈正相关，这意味着某种功能结构。
• 女性左室和右室中vCM的百分比较高（56±9％），与vCM和FB之间的较强负相关性相关（r = -0.8;斜率= -0.9）与男性心脏相比（47±11％; p值= 0.03;vCM：FB，r = -0.4； 斜率= -0.3）。 鉴于女性平均心脏质量较小，并且如果已确认，CM比例的差异是出乎意料的可能解释了女性心脏中风量增加和较低的心血管疾病率。

心肌异质性

主要结果

1. 获取了aCM(心房肌细胞）和vCM（心室肌细胞）的测序结果。
2. 发现aCM、vCM都可以被分成5个类群，每个类群有不同的特点。

分析

1. 总体来看CM都高表达压力抵抗以及肌节生成有关的基因(TTN, MYBPC3, TNNT2)以及钙调控有关的基因(RYR2, PLN, SLC8A1)
   
   Extended Data Fig. 3a,b高糊图像，但还是能辨别这些高表达的肌生成以及钙调控有关的基因
   并且vCM\aCM有明显的差别，这与bulk RNA-seq的结果一致。
2. vCM与aCM的差别体现在：vCM多表达肌节相关蛋白 (MYH7,
   MYL2)、转录因子(IRX3, IRX5, IRX6, MASP1, HEY2)其他丰度较高的转录本在功能上整合组织使心室有较强的抗张能力（例如PCDH7编码钙粘粘蛋白，SMYD2赖氨酸甲基转移酶促进肌节的形成和稳定）。aCM则表达一些经典蛋白，如ALDH1A2促进视磺酸合成，ROR2参与Wnt信号通路在谱系分化中起作用，SYNRP作为压力感受器在TRP机械门控通道中起作用。

3. vCM分为5群。vCM1组成左心室心肌的63.9%，但在右心室仅36.7%。vCM2的构成比与vCM1相反（左心室39.9%，右心室9.1%），但是它们的表达谱差别很小，这显示了左右心房相似的功能以及基因表达模式。

   
   Figure 2a, b鉴定出5群心室肌细胞以及这些vCM细胞的分布
   

   但是vCM2高表达PRELID2我们目前还不知道它的功能。vCM2还高表达MYH16和CDH13(细胞表面的钙粘蛋白受体），能够结合心脏保护脂联素和低密度脂蛋白，
   与多种心脏代谢特征有关。
   

   vCM3和vCM4遍布整个心室。vCM3类似RA population（表达视磺酸有关的基因MYH9, NEXN, CNN1)，vCM3还表达压力感应有关的基因ANKRD1, FHL1，DUSP2718, and XIRP1/XIRP2它们与心肌闰盘的离子通道作用参与心肌病以及心律不齐的调控。vCM4高表达核编码的线粒体基因(NDUFB11, NDUFA4, COX7C, COX5B)，GO分析显示这些基因与高能态相关。 Extended Data Figure 3f
   vCM4也有高水平的CRYAB表达，这是一种保护细胞的抗氧化剂热激蛋白能够保护肌小节。vCM4可能比其他vCM有更强的适应能力以及工作负荷。
   vCM5 (~1%) 高表达 DLC1 and EBF2，调节棕色脂肪细胞分化并且可能调节心脏起搏以及神经元谱系的转录本(SOX5, EBF1,KCNAB1)表达。 EBF1缺乏会产生发育不良的心室传导系统，这说明vCM5可能参与心脏的电生理过程。
4. aCM也分为5群。
   Figure 2e, f
   ,调控离子稳态，在左右心房肌细胞中分布不均50% of RA CM vs. 3% LA CM
   详见下方众多荧光图这显示了左右心房在活力状态上的差异。的确切功能并不清楚，但是Hamp-null 小鼠会发生电子传导链缺陷以及致死性心肌病。
   aCM1高表达经典的心室肌细胞转录本，显示了aCM的基本的基因表达模式，低表达神经元功能相关的基因。aCM2高表达RA信号通路相关的基因（）以及GRXCR2，支持纤毛参与的机械感应。
   从心房心室的起源角度进行分析，aCM3\vCM3表达谱相似都有SMC、CNN1的富集。aCM2\aCM3\vCM3相似的分子特征暗示了它们从second heart field的共同起源。aCM4\vCM4都有很高的代谢活性，NPPA表达量最高。aCM5、vCM5相似。

下面的figure都是补充展示不同的vCM、aCM的基因表达差异，此处不再一一解析。

Extended Data Figure3 c见PRELID2在vCM2高表达
Extended Data Figure3 e
Figure 2 cdgh，c为vCM2特征基因，dh在vCM3中表达
Extended Data Figure3 d

血管，基质和间皮细胞

1. 我们发现了17个在解剖学以及动静脉上具有差异的细胞类群。
   Figure 3a, b, Supplementary Table 8, 9
   内皮细胞由10个类群标志物为pan-EC markers PECAM1, CDH5 and VWF

• (Extended Data Figure 4a-c,g)

2. 三种毛细血管内皮细胞 EC (EC1-3_cap),表达 RGCC and CA429, 占所有内皮细胞的57.4% 。 Capillary-like EC4_immune 表达抗原提呈和免疫应答相关的 (CX3CL1, CCL2, IL6 and ICAM1)。
   动脉EC5_art 高表达 SEMA3G, EFNB2, DLL4, 但静脉 EC6_ven 表达静脉的标志marker NR2F231 and ACKR132,通过 smFISH验证

• (Figure 3c)
  动脉EC7_atria主要表达SMOC1（一种血管再生调节因子）、NPR3在鼠的心内膜细胞中同样表达，这说明EC7_atria可能是心内膜细胞。淋巴内皮 EC8_ln, 高表达PROX1,TBX1 and PDPN, 仅占所有内皮细胞的~1% 。

心脏成纤维细胞

免疫细胞与心脏稳态

传导系统和神经元细胞

脂肪细胞

COVID-19以及GWAS疾病相关

Experimental methods