系统学习单细胞转录组测序scRNA-Seq(二)

刘小泽写于19.3.16
看了一篇综述，又加了一些扩展知识

文章

这是一篇2017发表在Genome Medicine上的文章A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications

背景

• 单细胞测序：《Nature Methods》2013年度技术；《Nature》2017年7月刊的封面推荐 ；《Science》2018十大科学突破榜首
• 研究细胞的方法：基因组DNA序列（碱基如何排列、各个序列的丰度）、染色质结构（常听说的3C、4C、5C、HiC等）、mRNA序列（排列与丰度）、非编码RNA、蛋白表达、蛋白修饰、细胞代谢【因此不只有scRNA，还有sc基因组、sc表观组】
• 一个细胞中的待研究分子是微量的，因此我们一般使用几千细胞或直接取组织（上千万甚至上亿），这样就可以积累足够的分子信息，可以开展 Genome-wide association studies (GWASs) 、鉴定SNPs
• 主要做什么：分离新细胞亚群、构建细胞间互作网络、体内与体外实验反应、细胞在不同器官的情况、不同人群比较、不同物种比较
• 总体≠个体：细胞异质性的存在（受精卵发育成个体，最终去向十分多样=》肌肉细胞、神经细胞等等，why？；肿块中心、周围、转移中的细胞各异，分离出来判断疗法有效性）
• 挑战：同时检查单个细胞中表达的数千种蛋白质（蛋白组研究范畴），这个完整性有待提高

名词

Barcoding

• 之前做单细胞，真的是一个个细胞取出来，然后独立构建文库测序（比如：流式细胞术、激光捕获显微切割LCM=》组织切片），但是这通量非常低（有点Sanger测序和二代测序对比的感觉）。
• 后来发展出高通量的方法，主要是给每个细胞加上独一无二的DNA序列（就是条形码barcode，就是为了识别），然后测序时将相同的barcode序列归为同一个细胞来源
• 单细胞转录组可以在polyT引物5'端加上barcode；单细胞基因组目前主要利用高效转座酶（transposase）Tn5实现

Spike-in

• Spike-ins can be used for assessing the level of technical variability and for identifying genes with a high degree of biological variability

• 每个细胞都是独特的，和普通的Bulk RNA-seq不同，材料不容易获得，不太好做重复，因此通过生物学重复来评价技术手段/数据质量的方法不靠谱。

• 但是数据质量还是需要评价的，那么就通过向每个细胞裂解液中加入已知序列与一定数量的合成mRNA，例如 external RNA control consortium (ERCC)【翻译的话，姑且翻译成：外源RNA对照联盟】开发的“内参”，可以根据RNA读数判断样本间差异

• 高ERCC含量与低质量数据相关

• 但是使用spike-in也有一些问题要注意：

  • has to carefully calibrate the concentration that results in an optimal fraction of reads from the spike-ins
  • spike-in mixes are sensitive to degradation
  • captured less efficiently than endogenous transcripts
  • Spike-in不适用于droplet-seq的方法

• UMI( Unique molecular identifier )

  • barcoding的变体，待扩增的RNA分子用随机n-mer寡核苷酸标记。设计不同标签的数量，大大超过待扩增的转录本，产生独特标记的分子，并允许控制扩增偏差【例如10-mer的UMI，就会有 4的十次方 约等于100万种变化】
  • UMI是一段随机序列，每一个DNA分子都有自己的UMI序列。可以大大降低PCR误差（比如：原来两个样本中某基因表达量相同，但是由于两个样本扩增效率不同，样本1为99%，样本2只有95%，那么同时扩增40个循环，这同一个基因就有了0.99^40 / 0.95^40 = 5.2倍差异，因此本来没有差异也会因为外界因素扩增效率的影响而产生“假阳性”）
  • UMI只用在3'转录本测序的方法中，如CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq

Dropout

• 基因在一个细胞中有表达，但在另一个细胞中未检测到（按照道理，每个基因应该都可以检测到，只是表达量多少）
• 可能源于RNA总量少导致扩增建库丢失 或者 RNA表达随机性

Mass cytometry

• 基于流式细胞法和质谱，其中使用元素标签标记的抗体检测蛋白质表达 - 允许在一次实验中对数千个单细胞上的数十种蛋白质进行平行测定

Split-pooling

• (Rosenberg et al. ) combinatorial barcoding to profile single-cell transcriptomes without requiring the physical isolation of each cell

• https://www.rna-seqblog.com/split-seq-single-cell-profiling-with-split-pool-barcoding/

  

Basic step

• The first, and most important, step in conducting scRNA-seq has been the effective isolation of viable, single cells from the tissue of interest
• Next, isolated individual cells are lysed to allow capture of as many RNA molecules as possible.
• Next, poly[T]-primed mRNA is converted to complementary DNA (cDNA) by a reverse transcriptase.
• Then, amplified and tagged cDNAfrom every cell is pooled and sequenced by NGS.

Types of material

• 理论上，任何真核生物细胞都可以
• Primary cells
  • 胚胎 embryo
  • 肿瘤 tumours
  • 神经 nervous system
  • 造血 haematopoietically derived cells
• The Human Cell Atlas
  • 2017年启动，“媲美人类基因组计划”，核心技术=》单细胞组学
  • 对人类37万亿个细胞进行细胞采集、分类和绘图，侧重描绘组织，而不是整个器官；后期阶段可以纳入器官及感兴趣的疾病小群体
  • 2018.3.8，Sanger研究所宣布人类发育细胞图谱（Human Developmental Cell Atlas ，HDCA）的初步项目25万个发育细胞测序完成

补充：测序平台

• 10X Genomics
  • 2016.2推出 Chromium；
  • 通量高（7分钟内完成100~80,000个细胞的捕获），周期短，成本低，细胞捕获效率高（单个样本细胞捕获率高达65%）；细胞活性要求>90% =》 适用于发现新细胞
  • 横向孔道逐个导入凝胶微珠Gel beads =》 第一个纵向道输入细胞 =》Gel吸附细胞=》微流控技术送到第二个纵向通道（“油tube”）=》油滴GEMs 【因此，一个油滴就是一个Gel bead，也就是一个细胞】=》收集到EP管 =》每个Gel bead表明都放满了各不相同的Barcode和UMI序列+polyT =》细胞裂解，polyT抓取mRNA的3'polyA
• BD Rhapsody
  • 分子标签技术（每个转录本标记特异性分子标签）=》单细胞水平上基因表达谱的绝对定量
  • 单次实验可制备100-10000个单细胞文库
  • CytoSeq特有的蜂窝板技术（20W+的微孔），避免了10X中存在的概率碰撞影响捕获效率问题
  • 可以多样本混合捕获；成像系统；转录组-蛋白组联合分析
• Wafergen公司 ICELL8
  • 基于微流控芯片，5184个反应孔
  • 每次运行可分离500-1000个细胞
  • 捕获效率为30%，成本相对较低
• Fluidigm公司C1
  • 通量低、成本高（2000-3000细胞需要18000-100000美元）、周期慢
  • 同时捕获96个细胞
  • 全长转录组
• llumina Bio-Rad
  • ddSEQ
  • 一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞
  • 组织功能、病情进展和治疗反应方面的协同作用
  • 捕获效率低，仅为3%；成本低
• 1CellBio => InDrop
• Dolomite => µEncapsulator

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