10X 单细胞测序原理
凝胶微珠
凝胶微珠是单细胞测序中的核心组成部分之一。凝胶微珠上修饰有特定的DNA序列，包括TruSeq Read ，10× barcode，UMI以及Poly(dT)。
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TruSeq Read 1是测序引物，一个微珠对应一种barcode，用于确定测定的序列来源于哪一个细胞。UMI用于确定单个cDNA在扩增过程中产生的拷贝数。Poly(dT)VN序列与mRNA的PolyA尾巴结合，逆转出cDNA，V代表除T以外的任意碱基，N代表任意的碱基。
简而言之，10× barcode是每个细胞的身份证，UMI是每个cDNA分子的身份证。
捕获细胞
microfuidic device
1.样本细胞悬液(Sample)
2.凝胶珠(Beads)
3.分离液(Oil)
通过微流控系统将磁珠与细胞混和，形成油包水液滴GEMs。
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细胞混悬液（含有裂解酶，逆转录酶等）首先与磁珠混合，每一个细胞与凝胶珠单独结合，然后与油混合形成油包水液滴droplet。90%-99%的油滴中都不含有细胞，剩余的液滴中绝大多数只含有一个细胞，以此来保证单个细胞的分辨率，液滴中含有的细胞数符合泊松分布。
逆转录
液滴形成后不久后细胞裂解，释放出RNA，蛋白质，DNA等。Beads上联接有包含ploy(dT)序列的接头，只有mRNA带有polyA tail，于是捕获到mRNA(实际上drop-seq采用3'端测序，就是为了检测polyA tail)。
保证每个beads只捕获一个cell？
第一是控制cell和beads的流速，
第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。
但是还有个别的droplet里面会两个或者更多的细胞，需要进行质控
TSO（Template switch oligo）是什么 -
Master Mix中带有反转录试剂，当mRNA被捕获后，反转录出cDNA的第一条链，沿着poly(dT)序列延申，然后在beads序列的3'端插入CCC，在mRNA的5'端插入TSO(Template Switch Oligo)引物,再对mRNA的TSO进行反转录。
TSO 是一种寡核苷酸，在逆转录过程中与逆转录酶添加的未模板化的C核苷酸杂交。TSO为全长cDNA添加了一个通用的5'序列，用于下游cDNA扩增
C碱基用于与TSO结合
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扩增
加入UMI引物，以cDNA为模板进行扩增。然后针对扩增片段进行质检，质检合格后进行建库。
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文库
质检合格后的cDNA打断成为200~300 bp的片段，然后通过末端修复添加P5，P7，read 2 r sequence，sample index 。通过引入两段测序引物可以实现双端测序。Sample index用来区分不同的样品。P5和P7接头是桥式PCR过程中与引物互补的序列。
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问题
只有一部分有珠子和细胞，避免double
10X的技术使得90%的液滴有且仅有一个磁珠，而且在液滴里包含酶的组分，旧有的dropseq需要先捕获再磁珠洗脱得到cDNA再转录。
单细胞测序的优势
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流式细胞术同样可以对细胞分群，但是只有几十个marker，单细胞测序可以根据所有差异表达基因细分亚群。
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