title：Efficient generation of dopaminergic-like neurons by overexpression of Nurr1 and Pitx3 in mouse induced Pluripotent Stem Cells

article，Neurosci Lett. 2016 Jul 28:626:126-34. doi: 10.1016/j.neulet.2016.05.032.

2.5，4 区，作者单位：伊朗

Note：非全文直译，是自己的理解整理，供自用

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※Highlight

1.帕金森病是一种多巴胺能神经元(DAergic) 选择性丢失的神经退行性疾病；

2.诱导多潜能干细胞(iPSCs) 在细胞治疗与再生医学中有优秀的特性

3.Nurr1 与 Pitx3 的过表达有效地促进了 iPSC 到多巴胺能神经元的转化

❤ 摘要

疾病： PD，特点是多巴胺能神经元的选择性丢失 → 细胞治疗：PSCs 在神经退行性疾病治疗的潜能；

模型：体外 in vitro多巴胺样神经元；使 iPSC 表达两大主要的多巴胺能转录因子；

方法：首先将小鼠成纤维细胞通过多西环素诱导为 iPSC 并进行鉴定（只研究人 iPSC 建立，略过本部分）→iPSC 通过慢病毒诱导过表达 Nurr1 与 Pitx3→得到的过表达两基因的 iPSC 通过一个五个阶段的 protocol 转化为多巴胺能神经元

结果：protocol结尾得到了多巴胺能神经元，证实了 marker（免疫染色）；在增强剂作用下可以专门合成与分泌多巴胺（生理）

结论：成功建立了 iPSC 诱导 DA 能神经元的模型，可能为细胞治疗提供依据

✍🏻 1.简介

中脑多巴胺能(mDA)神经元在脑中的关键作用：认知功能、奖赏功能、自主运动 🆚 病理：神经与精神疾病，如精神分裂症、药物成瘾、PD → PD 治疗：药物 左旋多巴与多巴胺能受体激动剂 → 药物具有肌张力障碍等副作用影响应用 → 细胞替代疗法有前景

iPSC 简介：iPSC 通过病毒诱导四个转录因子Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc（yamanaka 因子）获得；细胞特性：在未分化的状态扩增，分化为三个胚层来源的细胞（外、中、内）；解决了胚胎来源的干细胞的伦理与免疫排斥问题；已有将胚胎干细胞与 iPSC 诱导为DA 能神经元的多个方法「见参考文献」；应用：细胞移植、PD 病因机制研究与药物筛选中

胚胎发育中参与调节多巴胺能神经元发育的几个转录因子介绍：

①Pitx3 

表达位置：鼠胚胎中的眼晶状体、骨骼肌与mDA 神经元，出生后只有 mDA 神经元；

作用 a）在 SH-SY5Y 细胞与原代腹侧中脑细胞中 pitx3 的过表达上调脑源神经营养因子（BDNF）与胶质细胞源神经营养因子（GDNF），对DA 能神经元的分化与存活有重要调节作用；b）在神经毒素作用下保护 DA 能神经元，神经毒素是导致多巴胺能神经元死亡的主要原因；c）调节 TH 的表达，TH 参与 DA 的合成

单独过表达 Pitx3 在胚胎干细胞或神经祖细胞中均无作用；

②Nurr1

表达起始于（小鼠胚胎）E10.5的中脑多巴胺能前体，并在接下来的发育阶段广泛持续；Nurr1缺乏的小鼠中存在幼稚的 DA 能神经元，但不能激活 TH 酶；Nurr1 通过结合Pitx3 启动子上的特异性 Nurr1结合域直接调节Pitx3 的表达；Nurr1 负调节炎症，炎症被认为是PD 发展的风险因素之一；Nurr1 还可以抑制星形胶质细胞和小胶质细胞来源的活性氧 ROS信号

总结：首先 Mckay 团队描述了从 ES 到DA 能神经元的五阶段 protocol；然后他们证明了 在同样的五阶段过程中，Nurr1表达的 ES 甚至可以增强DA 能神经元的生成；本实验目的是证实Nurr1 与 Pitx3 在 iPSC 中的共表达是否能增强DA 能样神经元的生成。

小鼠胚胎发育过程网站：https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Mouse_Timeline_Detailed

🚧 2.实验方法

2.1 ※慢病毒颗粒合成

组成：LvOSKM (Addgene plasmid 20328), LvM2rtTA (Addgene plasmid 20342), LvGFP, LvNURR1 and LvPITX3，在以往论文中有详细介绍

简而言之，在357μL 双蒸水(ddH2O)中制备4μg 包膜质粒(psMD2G) ，7.5 μg 包装质粒(psPAX2)和11.5 μg 转移载体(携带 OSKM，M2rtTA，GFP，NURR1，PITX3)的混合物，并使用 CaPO4沉淀法转染到293T 细胞(每10cm 培养皿3 × 106个细胞)中并培养72小时。收集含有病毒的培养上清液，通过0.8 μm 过滤器，并使用前述方案进行滴定，在以往论文中有详细介绍

2.2-2.6 小鼠来源的iPSC细胞系建立与一系列检测

2.3 碱性磷酸酶染色；2.4 畸胎瘤形成检测；2.5 核型检测；2.6 基因组测序；

2.7-2.11 后续细胞生成与检测

2.7 ※生成过表达 Nurr1 与 Pitx3 的 iPSC

①在8 μg/ml 的 polybrene 存在的情况下，转导相同体积的 LvNurr1 与 LvPitx3，iPSC 细胞数量为 10 的五次方个；GFP 作为对照组，同样的以 10 的五次方个细胞情况下转染 LvGFP；

②选择群落：嘌呤霉素浓度1 μg/ml，时间一周，将克隆转移至 24 孔板培养；

Nurr1 等基因的表达使用 rtPCR，引物在表中列出：

表 1 PCR 使用的引物

2.8 将 Nurr1/Pitx3 过表达的 iPSC 分化为 DA 能神经元

实验分组：共 3 组；①iPSC-F（对照无处理）；②Nurr1/Pitx3-iPSCs-F（接受了五个阶段信号分子刺激的且过表达）；③Nurr1/Pitx3-iPSCs（过表达了转录因子但没有经过五阶段处理）

分化的第一阶段：Nurr1/Pitx3-iPSCs 在 LIF 存在下在灭活的 MEF 上常规培养（有 feeder 层养法，我们不需要 feeder 层，以 matrigel代替）

第二阶段：用0.05% 胰蛋白酶制备单细胞悬液进行胚状体(EB)形成。将单细胞以补充有3% SR 的 KO DMEM 中的105个细胞/平方厘米的密度转移到非贴壁悬浮培养的6孔板上4天。两天后在 LIF 存在下形成 EB，然后再用维甲酸(RA; 10-8M)处理2天。在含有10% FBS 的 ES 细胞培养基中，将 EB 转移到涂有0.1% 明胶(Sigma)的24孔粘附性组织培养板中。

第三阶段在细胞铺板后24小时开始。在此阶段，培养基替换为补充有1% SR，胰岛素/转铁蛋白/硒(ITS)的 KO DMEM 培养基8天，选择Nestin+细胞。

第四阶段，将细胞在补充有 N2，SHH (500ng/mL) ，成纤维细胞生长因子2(FGF2)(10ng/mL) ，成纤维细胞生长因子8(FGF8)(25ng/mL)的 KO DMEM 培养基中培养7天。培养基在第4阶段每两天更换一次。

第五阶段，将细胞在补充有 N2，抗坏血酸(AA; 100μM)和肝素(0.33单位/mL)的 KO DMEM 培养基中再培养7-9天。

2.9 mRNA 表达检测

rtPCR：提取 RNA，逆转录，PCR；内参：B2M

其他以自己的试剂盒配方为准。

2.10 细胞免疫荧光

固定：4% 多聚甲醛(PFA; Sigma-Aldrich)30分钟

透化：PBS+0.2% Triton X-100，30分钟

封闭：1% BSA溶于PBS+0.1% TritonX-100，30-45分钟

一抗：hNURR1(AbCam，N1404, 1:300) ，Nestin (Santa Cruz，sc-33677, 1:500) ，TH (Sigma-Aldrich，T1299,1:2000)、 Gklf (Santa Cruz，sc-20691) ，Oct4(Santa Cruz，sc-9081)和 Nanog (AbCam，ab80892,1:1000)溶于 1%BSA ，过夜

二抗：室温 1-2h，避光

染核：避光， DAPI 溶液(Sigma-Aldrich 1:2000)，5分钟

2.11 检测 DA 合成与分泌

反相高效液相色谱法：在 Hanks 平衡盐溶液(HBSS)洗涤两次 DA 能神经元后，HBSS中溶解 200μL 的56mM KCL 去极化15min，然后收集上清液并转移到一个干净的黑色管子中，加入五十微升0.1 m 高氯酸(PCA)。将体积为250μL 的样品转移到管中，加入10μL 甲醇。混合并以12000 g 离心2分钟后，将10μL 的体积注入色谱仪。分泌的儿茶酚胺的量通过反相高效液相色谱法使用来自默克，德国，在室温下操作的带有guard的色石 C8(100 × 4.6)柱进行分析。流动相由0.05 M 磷酸氢钠(pH3.2)、0.1 M EDTA 二钠、0.5 M 十二烷基硫酸钠(SLS)和10% (v/v)乙腈组成。流动相在体系中的流速为1.5 mL/min。保护细胞的电位设定在650毫伏。

📚 3.结果

3.1 小鼠 iPSC 细胞系的建立与特征鉴定

略，图 1  在四环素诱导型启动子控制下携带多能性基因的慢病毒载体结构，iPSC 群落的形态；

图 2 iPSC检测：转录水平检测，成瘤实验，免疫荧光，核型检测→检测多能性标志以及细胞系正常建立。

3.2  ※Nurr1/Pitx3-iPSCs建立与特征鉴定

建立在 Mckay 团队证实 Nurr1 过表达增强最终分化为 DA 能神经元的效率，本文共表达 Nurr1、Pitx3；

分化的心肌细胞的搏动性说明了细胞分化为中胚层的潜能。

图3 （A）验证 LvNURR1和 LvPITX3感染后 iPSC 中的 NURR1和 PITX3转录物表达(B)显示 Nurr1蛋白表达的 NURR1/PITX3-iPSC 的免疫荧光染色

图 3总结：通过对 mRNA 水平与蛋白水平的检测对外源性的两种基因的表达检测

3.3 ※信号分子对产生 DA 能神经元发育过程的中间神经元的作用

图4 五阶段示意图

主要基于 Mckay 的方法进行少许修改；

阶段 1：未分化 iPSC；阶段 2：神经外胚层 NE形成；阶段 3：中枢神经系统干细胞 CS形成；阶段 4：中脑神经元 MN形成；阶段 5：多巴胺能神经元 DN 形成；

图5 神经元标志检测

5A：Nestin 在 CS 阶段结束时检测，即相当于NPC 阶段，检测 NPC 的标志物 Nestin；

5B：第4阶段MN 的标志物检测的是 LMX1B,FOXA2 等基因

3.4 基因过表达模型在具有功能的DA 能神经元分化中起到的作用

图6 多巴胺能神经元标志物鉴定与生理功能鉴定

😅免疫荧光的图丑出天际了吧

6A 检测神经元、DA 相关的标志，以及内源性的 Nurr1、Pitx3 基因；

6B DA 能神经元必备鉴定：TH 免疫染色

6C 质谱检测 DA 分泌水平，两基因的协同作用与信号分子的作用均可以促进多巴胺的合成

❀ 4.讨论

两种关键的转录因子与重要的信号分子（SHH、Wnt1 、FGF8）在体外转变 DA 能神经元中起到重要作用

扩展：备选的关键转录因子（FoxA2, Lmx1a, Lmx1b, Msx1, Ngn2, Nurr1, Pitx3）

重新总结了一遍实验顺序并且列出了一些其他研究对比，只提出了自己的研究的优势，没提缺点😅

by 杂草：

本文为构建慢病毒载体直接将 iPSC 诱导为 DA 能神经元提供了一个思路

本文中结果不太可信，主要还是框架

思考：这篇文章像是一个半成品，每一步的结果都是那么不靠谱，成本极低，对我的价值是提供了一个引物列表，验证需要检测的转录因子，以及对多巴胺能神经元提供了一个参考文献列表

未完待续😁

DA 能神经元方法学参考文献：

4. Clinical application of stem cell therapy in Parkinson’s disease BMC Med., 10 (2012), p. 1

6.Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease Nature, 480 (2011), pp. 547-551

很经典的 ，Kriks

7.Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease J. Clin. Invest., 121 (2011), pp. 2326-2335

8.Efficient generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells under defined conditions Stem Cells, 28 (2010), pp. 1893-1904

9.Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson’s disease Nature, 418 (2002), pp. 50-56

Mckay 团队的

10.Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells Nat. Biotechnol., 18 (2000), pp. 675-679

Mckay，可能先有了方法后发了 2002 的文章

27. Decreased NURR1 and PITX3 gene expression in Chinese patients with Parkinson’s disease Eur. J. Neurol., 19 (2012), pp. 870-875

瑞金医院：检测患者的外周血淋巴细胞内两个基因的表达水平下降，表达水平与 PD 风险负相关

29.Midbrain dopamine neuron differentiation: factors and fates Dev. Biol., 304 (2007), pp. 447-454

看上去像个综述，讨论里面提到的，可以一看