文献学习050--[sc+st]心脏成纤维细胞通过Htra3-T
Nat Commun. 2022 Jun 7;13(1):3275.
组织纤维化和器官功能障碍是包括心力衰竭在内的与年龄相关疾病的标志，但这两种事件是否存在共同的诱发途径仍然未知。通过scRNA-seq、空间转录组和genetic perturbation，该研究阐明了high-temperature requirement A serine peptidase 3 (Htra3) 通过降解TGF-β来维持quiescent心脏成纤维细胞的特性，是心脏纤维化和心力衰竭的关键调节因子。压力超负荷下调心脏成纤维细胞中 Htra3 的表达并激活 TGF-β 信号传导，通过 DNA 损伤积累和诱导衰竭心肌细胞的分泌表型，引起心脏纤维化和心力衰竭。心脏中 Htra3 的过表达抑制 TGF-β 信号传导并改善压力超负荷后的心脏功能障碍。 Htra3 调节的时空心脏纤维化诱导和心肌细胞分泌表型在心肌梗塞后的梗塞区域中特别观察到。对人类单心肌细胞转录组和血浆蛋白质组的综合分析表明，IGFBP7 是 TGF-β 下游的细胞因子，由衰竭的心肌细胞分泌，是晚期心力衰竭的可靠诊断标志物。这些发现突出了心脏成纤维细胞通过 Htra3-TGF-β-IGFBP7 通路调节心肌细胞稳态和心脏纤维化的作用，这将成为心力衰竭的治疗靶点。
思路总结
1. Single-cell network analysis identifies Htra3 as a central molecule of cardiac fibroblasts.
Fig 1A：作者分选了TAC2w和sham小鼠心脏的所有非心肌进行了10x单细胞，又额外分选了PDGFR-a成纤维细胞，进行了Smart-seq2单细胞测序。
Fig 1B：使用数据库中1019个受体和配体 (LR)的表达谱，作者使用WGCNA构建了一个共表达网络，揭示了心脏中LR的细胞类型特异性转录特性。
Fig 1C：根据受体配体对构建了细胞互作网络
B和C都是使用1019个LR基因的表达矩阵做的，区别是B是WGCNA构建的相关性网络，C是根据受体配体对构建的互作网络。
Fig 1D：和sham相比，TAC2w小鼠心脏出现了I3K-Akt, Rap1和TGF-β通路的高表达（没有区分细胞类型）
Fig 1E：细胞互作结果显示，成纤维细胞和其他细胞具有最多的互作。
Fig 1F：在TAC2w小鼠上调的通路中，也出现了多条细胞外基质和胶原形成的通路激活
Fig 1G：随后作者构建了成纤维细胞的共表达网络，发现Htra3处于网络的中心位置。
Fig 1H：Htra3的表达与心脏成纤维模块呈显著正相关，提示Htra3定义了心脏成纤维细胞的特性。（Dcn (decorin)和Islr (Meflin)是TGF-β信号通路相关分子）
Fig 1I：单细胞的数据也提示了成纤维细胞特异性的Htra3表达。
Fig 1J, K：分别在人和小鼠的心脏切片上验证了成纤维细胞Htra3的表达。
思路：先细胞后分子
1. 定位到成纤维：细胞互作网络中成纤维和别的细胞互作最多+心脏出现纤维化相关通路的上调
2. 定位到Htra3：做了成纤维细胞的WGCNA共表达网络，发现Htra3处于核心位置。
2. Cardiac fibroblast Htra3 governs cardiac homeostasis and is downregulated by pressure overload.
为了进一步探究Htra3在心脏的功能，作者首先构建了Htra3的敲除鼠
Fig 2A-C：Htra3 KO鼠在没有做TAC的情况下也出现了心室壁增厚，心腔增大的表现。在轻度压力负荷的TAC下，Htra3 KO鼠出现显著心衰，sham鼠则没有这种情况。
Fig 2D：天狼星红染色染色也显示和WT相比，Htra3 KO鼠出现了更明显的纤维化。
Fig 2E：和sham相比，TAC鼠心脏成纤维细胞出现了Htra3的下调
Fig 2F：心衰患者的单细胞测序结果也显示其心脏成纤维细胞出现了Htra3的下调
Fig 2G：体外培养的成纤维细胞给予牵张刺激后出现Htra3的下调和Tgfb1的上调
3. Htra3-induced TGF-β degradation is essential for the prevention of heart failure and fibrosis
为了进一步探究Htra3在心脏纤维化中的功能，作者分选了WT和Htra3 KO小鼠Sham/TAC 2W的Pdgfrα+心脏成纤维细胞，进行了Smart-seq2单细胞测序。
Fig 3A, B：聚类得到3个群，轨迹分析得到2条分化轨迹。
Fig 3C：轨迹1 (C1-C2) 主要是由Htra3 deletion引起的，轨迹2 (C1-C3) 主要是压力负荷引起的(不管有没有Htra3 KO)。
Fig 3D：共表达网络和随机森林分析显示M1和M17 were mutually exclusive in their module activity.
这两个图放在附件里，但是是对文章结构很重要的两张图。左图是对所有细胞做了
WGCNA分析，得到了不同的模块，然后对模块进行了随机森林分析，右图是基于精准度的重要性排序，选了前两个重要性top2的模块。
参考：WGCNA原理和分析流程；单细胞WGCNA分析方法+随机森林；使用randomForest包进行随机森林分析；
Fig 3E-G：M1包含参与固有免疫和TLR信号通路的基因，而且M1的活性在轨迹1和2都被抑制。而且从G图看，轨迹1和2中M1的抑制都与Htra3的下调有关，提示Htra3是维持心脏成纤维细胞静息状态的关键分子。
Fig 3H-J：M17主要富集到细胞外基质形成和TGF-β信号通路，而且它的活性在轨迹1和2中都有不同程度的上调。从J图看，不管是压力负荷还是Htra3的敲除都可以诱导M17的活化，而且两者在活化M17方面具有协同效应。
这些结果提示Htra3 basically 抑制TGF-β信号通路，而压力负荷或Htra3敲除可以协同作用活化TGF-β，引起成纤维细胞的活化。
随后作者在体内和体外探究了Htra3对TGF-β的抑制作用
Fig 3K：在对心脏原代成纤维细胞进行Htra3的过表达可以降低TGF-β1和pSmad2/3(TGF-β信号通路活化的标志)的蛋白水平。
Fig 3L：而且Htra3直接和TGF-β结合，提示Htra3通过直接与TGF-β结合降解TGF-β。
Fig 3M：pSmad2/3免疫荧光的结果提示Htra3敲除和TAC都可以活化Smad2/3，而且两者同时存在时不仅活化了成纤维细胞的Smad2/3，心肌细胞的Smad2/3也出现了活化。
而给予TGF-β中和抗体则显著改善了Htra3 KO小鼠TAC手术后的心功能和心脏纤维化（附件）。
4. Htra3 repression-induced activation of TGF-β signaling promotes the induction of senescent failing cardiomyocytes.
为了理解活化的TGF-β信号通路是如何影响心肌细胞并引起心衰的，作者对WT和Htra3 KO小鼠Sham/TAC 2W的心肌细胞，进行了单细胞测序。
Fig 4A, B：聚类得到4个心肌细胞群
共表达网络和随机森林鉴定出模块M1和M2显著参与了细胞分类（附件）。
Fig 4C：Htra3敲除，TAC和两者协同分别可以引起心肌细胞从C1向C2, C3, C4转化。
Fig 4D-F：模块M1，主要参与线粒体氧化磷酸化和DNA修复，在轨迹1和2中都被抑制，提示TGF-β信号通路抑制这些通路基因的表达。
Fig 4G-I：模块M2，参与小GTPase信号通路、TGF-β受体信号通路、p53信号通路等，沿着轨迹2在C4细胞群中显著激活。
Fig 4J：Htra3 KO和TAC压力负荷的协同作用显著诱导了心肌衰竭。
Fig 4K：Htra3 KO和TAC压力组，心肌细胞出现了DNA损伤相关基因的表达。
Fig 4L：M2也包含着多种分泌蛋白的表达，比如Bmp1, Cxcl12和Igfbp7，提示cardiomyocytes expressing M2显示出DNA损伤诱导的分泌表型，和senescence-associated secretory phenotypes (SASP)相似。
Fig 4M-O：聚类结果显示模块M9（主要富集到胶原纤维形成蛋白如Tgfb3, Nox4和Postn）也在C4 like M2中显著活化。
5. TGF-β-induced Nox4 expression and subsequent p53 activation are essential for the induction of failing cardiomyocytes with secretory phenotype.
Fig 5A：为了探究M9中TGF-β诱导的Nox4活化（心肌细胞中一个关键的ROS-generating NADPH oxidase）是否参与DNA损伤和心衰的发展，作者注射了Nox4- shRNA AAV9来抑制Nox4的表达
Fig 5B：超声结果显示knockdown Nox4改善了Htra3 KO鼠TAC后的心功能。
Fig 5C, D, E：免疫荧光和WB的结果显示knockdown Nox4显著降低了DNA损伤和TGF-β信号相关分子的表达。
Fig 5F-J：作者随后对TAC 1w WT鼠注射了AAV9-Htra3，Htra3在心脏的过表达抑制了TGF-β信号，减轻了心脏功能恶化和纤维化。
These results suggest that TGF-β signaling induces accumulation of DNA damage and subsequent activation of p53 signaling by repressing DNA repair genes and promoting Nox4-mediated ROS production, resulting in the induction of senescent failing cardiomyocytes, which are characterized by the expression of TGF-β signaling-related molecules and secretory factors. Htra3-induced TGF-β repression might be a therapeutic approach for heart failure.
6. Spatial transcriptome reveals that the Htra3-TGF-β axis is essential for the prevention of cardiac fibrosis and cardiomyocyte secretory phenotype induction in infarct regions after myocardial infarction.
为了进一步探究Htra3是如何在空间上调控心脏重塑，作者在MI模型中探究了Htra3的作用。（空转也是送了WT/Htra3 KO和sham/MI这四组）
Fig 6A：Htra3在MI的梗死区高表达，提示它具有潜在的参与心脏重塑的作用。
Fig 6B, C：Htra3 KO鼠显示出显著的心脏扩张和收缩功能障碍
Fig 6D, E：空间聚类分析得到5个空间cluster。1群主要在MI组(both KO/WT)，是MI诱导表达基因，与线粒体基因表达有关。2群主要是梗死区细胞，与细胞外基质沉积、TGF-β信号通路、炎症反应、整合素介导的信号通路等有关。
Fig 6F：使用单细胞数据对空转的结果进行注释，提示成纤维细胞在2群显著富集。
Fig 6G-H：对MI的心肌细胞做了拟时序，找到了一些拟时相关基因。
Fig 6I：这些基因和细胞外基质基因一起，特异性的在Htra3 KO鼠MI后的梗死区表达。
suggesting that Htra3 downregulation promotes cardiac fibrosis and induces cardiomyocyte secretory phenotype in infarct regions.
7. Transcriptomic signatures of failing cardiomyocytes are conserved in human heart failure.
为了验证前面的结果，作者对22个心衰患者和2个正常对照的心肌细胞进行了smart-seq全长单细胞测序。
Fig 7A, B：心肌细胞分为三群，存在两条分化轨迹。轨迹1是C1-C2，轨迹2是C1-C3。
Fig 7C：正常对照的心肌主要是C1，患者的则主要是C2/C3。
和前面一样，作者随后做了WGCNA和随机森林，找到了两个核心模块1和2。这两个模块和前面小鼠心肌细胞的模块2和1具有很高的相关性。前面提到的小鼠M9和人的M44有很好的相关性。
Fig 7D-F：模块2（对应小鼠心肌模块1），富集到的基因主要与线粒体电子传递和ATP生物合成有关，在两条分化轨迹中都被抑制。
Fig 7G-I：相反，模块1（对应小鼠心肌模块2）富集到的基因主要参与I型干扰素反应，TGF-β信号通路，小GTPase信号通路，DNA损伤反应等，在轨迹2中显著激活。M1还表达一些在小鼠senescent failing cardiomyocytes中表达的分泌因子(e.g., CXCL12和IGFBP7)
Fig 7J：M1和M2在心肌细胞中的模块活性也是mutually exclusive relationship。
Fig 7K-M：小鼠M9对应的M44，富集到的基因主要与细胞外基质形成有关，并且特异性的在轨迹2激活。
These results suggest that human failing cardiomyocytes show the same conserved features as murine failing cardiomyocytes, including impaired mitochondrial biogenesis, activated TGF-β receptor signaling, DNA damage response, and fibroblast-like secretory phenotype.
8. IGFBP7, secreted from failing cardiomyocytes, is identified to be a biomarker for progression of heart failure.
为了探究衰竭心肌分泌的细胞因子是否与心衰进程有关联，作者对不同时间点的84例非进展期心衰患者、30例进展期心衰患者和768例对照进行了血浆蛋白组学分析。
Fig 7N：senescent failing cardiomyocytes 分泌的细胞因子如TGF-β3, LTBP4和IGFBP7(在附件)，在心衰患者血浆中都有上升，在移植后则下降，和心衰标志物NT-proBNP一样。
Fig 7O：在这些分子中，随机森林法鉴定出IGFBP7是鉴定非进展期和进展期心衰最强的分类标志物。
Fig 7P, Q：ROC结果提示，NT-proBNP对心衰诊断效果最好，而IGFBP7确定心衰严重程度效果最好。
These results suggest that IGFBP7, secreted from failing cardiomyocytes, is a useful biomarker for advanced heart failure in humans.
这一篇文章的数据测的相当多，做的也比较完善。单细胞分析比较关键的一个点是WGCNA+随机森林(Fig 2, 4, 7)。这篇文献做WGCNA是对单一细胞类型做的，思路可以参考。
