转录组流程（Hisat2（略）+StringTie+ballgo

• 我这里只是用了4个数据进行测试，分成两组（随意写的，仅供测试，在ballgown可以看到）；
• hisat2比对后，samtools sort生成sort.bam，用于stringtie的输入；
• stringtie的推荐版本使用bam生成了gtf格式的文件，后利用gtf生成非冗余转录本，用于下一步分析；
• stringtie的fast版本则直接生成了最终结果；

1.Hisat2

• 上游利用了hisat2进行比对（网上教程颇多，这里不再赘述），整个采用的是hisat2+StringTie+ballgown;

2.StringTie

• 差异分析应用，StringTie有两种模式，官方推荐和fast模式；
• StringTie --merge 功能可生成在所有样本中均出现的非冗余转录本；输入文件是上一步生成的组装文件（GTF格式）和参考注释文件（我这里使用的是gencodeV29）；

2.1.StringTie-recommend

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2.1.1生成每个样本的组装文件（gtf格式）

R=/teach/database/gtf/gencode.v29.annotation.gtf
for file in $(ls ~/airway/04align/*.sort.bam);
  do
  out_file1=${file##*/}
  out_file=${out_file1%.sort.bam}
  #echo $out_file1 $out_file
  stringtie ${file} -l ${out_file} -p 5 -o ~/airway/stringtie_recommend/${out_file}_hg38.gtf -G $R 2>~/airway/log/stringtie_${out_file}.log2
done

2.1.2 生成mergelist.txt（即之前生成的gtf文件）

ls ~/airway/stringtie_recommend/*gtf > mergelist.txt
##基于组装结果生成非冗余转录本
R=/teach/database/gtf/gencode.v29.annotation.gtf
stringtie --merge -p 8 -G $R -o stringtie_merged.gtf ~/airway/stringtie_recommend/mergelist.txt

2.1.3生成ballgown需要的结果

• -B/-b 估计转录本丰度并生成Ballgown所需的文件
• -e（只采纳给定的参考转录本）

R=/teach/database/gtf/gencode.v29.annotation.gtf
for file in $(ls ~/airway/04align/SRR1039513.sort.bam);
  do 
  out_file1=${file##*/}
  out_file=${out_file1%.sort.bam}
stringtie -e -B -p 8 -G stringtie_merged.gtf -o ~/airway/stringtie_recommend/${out_file}/${out_file}_hg38.gtf $file 2>~/airway/log/stringtie_re_${out_file}.log2
done

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2.2.StringTie-fast

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R=/teach/database/gtf/gencode.v29.annotation.gtf
for file in $(ls ~/airway/04align/SRR1039513.sort.bam);
  do
  out_file1=${file##*/}
  out_file=${out_file1%.sort.bam}
  mkdir ~/airway1/08stringtie/${out_file}
  #echo $out_file1 $out_file
  stringtie ${file} -B ~/airway1/08stringtie/${out_file} -o ~/airway1/08stringtie/${out_file}/${out_file}.gtf -G $R 2>~/airway1/log/stringtie_${out_file}.log2
done

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3.ballgown

因为我使用的数据是抽取了部分reads往下进行的，所以，这里未展示差异分析结果；

library(ballgown)
bg = ballgown(dataDir='~/ballgown/08stringtie', samplePattern='SRR', meas='all')
pData(bg) = data.frame(id=sampleNames(bg), group=rep(c(1,0), c(2,2)))
stat_results = stattest(bg, feature='gene', meas='FPKM', covariate='group',getFC = T)
head(stat_results)

参考内容：
1.stringtie_manual