习得RNA测序秘籍，让你打遍天下无敌手~
话说当年
华山思过崖
一代大侠风清扬将华山派剑法绝学
《独孤九剑》
传授给当时还是愣头青的令狐冲。
《独孤九剑》，活学活使，只是第一步，
要做到出手无招，那才真是踏入了高手的境界。
“要切肉，总得有肉可切;
要斩柴，总得有柴可斩;
敌人要破你剑招，你须得有剑招给人家来破才成。
学武之人，使兵刃、动拳脚，总是有招式的，
你只须知道破法，一出手便能破招制敌。”
令狐领悟其剑法之精髓
——以无招胜有招，杀尽仇寇奸人，败尽英雄豪杰，打遍天下无敌手。
所谓“无招胜有招”，
即不拘谨于招式，将招式灵活熟练运用于实践之中，
在与敌对招时便自然而然使出这一招。
剑锋所至之处，
万般难题迎刃而解，
噫吁嚱，危乎快哉!危乎准矣!
在所研究的物种不具备参考基因组时，通过de novo分析策略，转录组测序可以帮助研究人员快速获取该物种的mRNA序列，并预测可能的非编码RNA。此外，在分析基因表达水平的同时，还可以获得cSNP，从而提供最全面的转录组信息。
对于真核生物来说，在具备参考基因组的情况下，基于Illumina HiSeq平台的mRNA测序能够快速获得基因表达谱;基于测定的序列可以同时对cSNP、可变剪接等转录本的序列及结构信息进行精确地分析;另外对于检测低丰度转录本和发现新转录本具有其独特的优势。
单细胞mRNA测序技术是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞中微量的mRNA通过高效扩增后再进行高通量测序。单细胞mRNA测序能够有效解决微量样本(如胚胎细胞、干细胞等)无法进行常规高通量测序，以及组织样本无法破解的细胞异质性(如神经细胞、肿瘤细胞)难题。
原核生物来的mRNA没有polyA结构，因此可采用rRNA去除的方法，采用链特异性测序同时对原核生物的mRNA和ncRNA进行高通量测序。
由于微生物群体通常具有高度的多样性，甚至同一菌种不同菌株之间都存在着很高的基因组变异度。因此，现有的基因组数据库根本无法满足大部分研究者的需要。例如轻症链球菌(Streptococcus mitis)不同菌株间的差异要高于5%;金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)不同菌株基因组序列间的变异率甚至能够达到20%。基因组的多样性往往导致了菌株致病性和耐药性的重大变化，而高度变异又导致这些菌株缺乏准确的参考基因组，这种情况严重阻碍了致病菌和耐药菌的功能研究。针对上述问题，可以利用迭代修正的方法不断矫正已知近缘物种的基因组序列，以获得研究物种相对精确的参考基因组，基于修正后的参考基因组，再进行RNA-seq的后续分析。
转录组是特定物种、组织或细胞在特定生理状态下转录的所有RNA的集合，包括mRNA和ncRNA,其中lncRNA(long non-coding RNA)是一类长度超过200nt的ncRNA，通过多种方式在表观遗传、转录及转录后水平发挥调控作用。全转录组测序在研究mRNA的同时，能够发现大量的lncRNA，并对其表达水平和转录本结构进行分析。当进一步开展lncRNA与mRNA的关联分析时，就可以深入研究lncRNA的调控网络。
单细胞全转录组测序技术是在单细胞水平对转录组进行扩增与测序，其原理是将分离的单个细胞中微量的mRNA和lncRNA通过高效扩增后再进行高通量测序。单细胞全转录组测序能够有效解决微量样本(如胚胎细胞、干细胞等)无法进行常规高通量测序，以及组织样本无法破解的细胞异质性(如神经细胞、肿瘤细胞)难题。
small RNA是指长度在18~30nt的内源性RNA，包括miRNA，siRNA和piRNA等。它们在mRNA的转录及转录后水平的调控中发挥重要作用，参与细胞生长、分化、代谢等各个生物学过程，对生物体的正常发育和疾病过程起着关键作用。small RNA测序是指基于高通量测序平台对目标样本的small RNA进行大规模检测，同时发现新的小RNA，结合生物信息学挖掘手段，研究small RNA的功能、结构和调控机制。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是在转录过程中,通过可变剪接形成的一类首尾相接的环状RNA分子。高等动物中circRNA的种类和含量远远超过预期。最近的研究发现circRNA可以作为“microRNA海绵”，即竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)，结合胞内miRNA，阻断miRNA对其靶基因的抑制作用。circRNA也可与蛋白形成复合体调节下游的靶基因。另外，circRNA的表达呈现出很强的组织特异性，也暗示circRNA具有重要的生物学功能。基于Illumina HiSeq平台的circRNA测序能够快检测样本中circRNA的种类并进行表达定量，结合生物信息学挖掘手段，研究circRNA的功能和调控机制。
看苍茫四海八荒
诸侯腥风血雨
RNA测序
连中八篇
剑气荡长空
预知后事如何
且听下回分解
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