002-H3.3-K27M突变事件驱动神经干细胞转化为胶质瘤

H3.3-K27M drives neural stem cell-specific gliomagenesis in a human iPSC-derived model.png

2020年，来自海德堡儿童癌症中心Marius Wernig团队和斯坦福大学Stefan M. Pfister团队共同在Cancer Cell杂志上发表了一篇题为H3.3-K27M drives neural stem cell-specific gliomagenesis in a human iPSC-derived model的文章。
这项研究基于人体诱导多能干细胞的模型，证明了组蛋白H3.3-K27M突变能够驱动神经干细胞转变为胶质瘤细胞，且细胞的遗传特征和生物学表现都与人类弥漫性中线脑胶质瘤十分类似，同时还指出K27M突变是通过作用于二价染色质(bivalent chromatin)发挥作用。

背景

• 儿童高级别脑胶质瘤在儿童脑肿瘤中占10-15%，预后常不良，致死率较高。目前并无对应的治疗方式。
• 在儿童高级别脑胶质瘤中，约有一半在脑干处呈现弥漫性生长的特点，主要位于桥脑处。这类肿瘤被定义为弥漫性内生型桥脑胶质瘤(Diffuse intrinsic pontine glioma, DIPG)。
• 据统计，80%的DIPG具有H3K27M突变，并通常伴有TP53突变（77%）和PDGFRA扩增。H3K2 7M主要发生在组蛋白H3F3A的异构体上，并具有广泛的DNA低甲基化特征。了解DIPG产生的机制有助于药物的研制和临床应用，并进一步对DIPG进行精确的分子分型以指导临床，改善预后。
• 但目前H3K27M致瘤的机制仍不明确。此前的研究发现，在鼠类神经祖细胞(Neural progenitor cells, NPCs)以及异体移植的人类胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)中外源表达K27M组蛋白H3.3，同时抑制TP53表达并增强PDGFRA的表达，能够导致胶质瘤样肿瘤。类似的，在神经干细胞和神经祖细胞中通过Nestin驱动，Cre诱导，内源性表达H3.3-K27M并同时敲除TRP53，能够导致DIPG样肿瘤产生。但是，鼠类神经祖细胞分群与人体尚存在诸多差异，因此基于鼠类神经祖细胞的研究结果与DIPG真实的特征仍存在一定差异，具有一定的局限性。

结果

• 首先，研究者分别在H3.3-K27M突变的DIPG细胞和原始的神经干细胞中过表达K27M突变的H3（分为H3.1和H3.3两种亚型）。尽管在H3K27me3水平在两组中都显著下降，但只有H3.3-K27M过表达能够增加DIPG来源细胞的调亡水平，并促进原始神经干细胞的增殖。因此，研究推测，H3.3的突变介导了细胞向胶质瘤的转变，而之后的研究也主要聚焦在组蛋白H3.3亚型突变的效应上。
• 由于外源性过表达突变型H3与细胞真实的遗传特征存在差异，因此研究者进一步通过CRISPR/Cas9 技术诱导同源重组，两个健康人体中获得的诱导多能干细胞中内源表达H3，并根据Cre选择性表达突变型和野生型组蛋白H3.3，真实重现了细胞发生组蛋白K27M突变后的生物学效应。研究进一步证实了H3.3-K27M的突变确实增加了神经干细胞(Neural stem cell, NSC)和少突胶质祖细胞(Oligodendrocyte progenitor cell, OPC)的增殖和凋亡水平。

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• 鉴于H3-K27M对于神经干细胞与少突胶质祖细胞的相似效应，研究者希望能够回溯DIPG瘤细胞究竟是起源于哪个分化的阶段？研究者分别在iNSC和iOPC的细胞中导入了H3F3-WT，H3F3-K27M，H3F3-WT/shTP53，H3F3-K27M/shTP53，并将其移植入NSG小鼠中。只有共转H3F3-K27M/shTP53的iNSC在小鼠的脑中形成了恶性肿瘤，其分子病理特征与DIPG十分类似。基于DNA甲基化芯片数据的无监督聚类分析发现，成瘤细胞与K27M突变的高级别脑胶质瘤更为相似。基于此，研究者认为，DIPG来源于发生H3K27M突变和TP53失活的神经干细胞。

  
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• 此前，其他研究也发现，DIPG瘤细胞具有类似少突胶质祖细胞(OPC)的表达谱特征，对本研究的结论做出了一定挑战。而本文也对此做了解释——H3.3-K27M突变同样影响了细胞命运决定相关基因的表达，使NSC也能表达类似OPC的分子标志物，从而进一步向OPC进行分化。

• 研究还发现，H3.3-K27M能够降低iPSC活力，削弱多能性重编程，有趣的是，EZH2抑制剂能够一定程度上抑制H3.3-K27M的效应。而从K27M突变前后转录组数据中可以发现，H3K4me3/H3K27me3多位于表达存在差异基因的转录起始位点(Transcription start site, TSS)位点附近。而表达H3.3-K4M组蛋白能够增加野生型iPSCs的凋亡水平，而在H3K27M的iPSCs中却并无此效应。这些发现提示着H3K27M致瘤效应可能建立在H3K4me3和H3K27me3的协同作用上，通过二价染色质(bivalent chromatin)调控有关基因表达来实现。二价染色质的特征是同时存在H3K4me3和H3K27me3的修饰，在胚胎干细胞中普遍存在，被认为是平衡型谱系控制的发育基因，可在胚胎发生期间快速激活，同时在没有激活提示的情况下保持转录抑制状态。

  
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• 进一步的CHIP-seq手段则显示，在未分化细胞中，H3K4me3/H3K27me3与组蛋白H3.3在关键发育调控基因存在重合，且其转录水平与H3.3和H3K27me3的水平密切相关。

  
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• 研究者猜测，除了抑制H3K27位点的三甲基化进而促进活跃转录基因的表达之外，H3.3-K27M还能够从准备状态(poised state)激活部分维持干性的基因，促使干细胞向肿瘤进行转变。后续的研究也证明了这一点，H3.3-K27M能够特异性地促进PDGFRA基因的表达，并破坏分化过程以维持细胞干性。

总结

• 这篇文章从肿瘤发生的角度，阐述了H3.3-K27M这一表观遗传学的事件对神经干细胞的影响，并在其胶质瘤化的过程中起到了关键作用。这一发现有助于我们早期诊断DIPG，并对DIPG患者进行分层治疗，个性化治疗。