ArchR官网教程学习笔记2:基于ArchR推测Doublet

系列回顾：
ArchR官网教程学习笔记1：Getting Started with ArchR

（一）什么是Doublets?

单细胞数据的一个主要问题是“doublets”对分析的影响。doublets是指单个液滴捕获了一个barcoded珠和多于一个的核。这就导致了从多个细胞读取的reads显示为单个细胞，该细胞实际上是两个细胞的平均值。在本章中，我们将用计算方法去除这些doublet，并详细描述去除doublet的过程。

（二）ArchR是如何识别Doublets的？

在任何平台上生成的单细胞数据都容易受到doublets的影响。doublets是指单个液滴接收一个barcode珠和一个以上的核。在10x平台下，总“细胞”中的doublets实际上与加载到反应中的细胞数成正比。即使使用标准试剂盒产生的较低水平的doublets，也有超过5%的数据可能来自doublets，这对聚类产生了重大影响。这个问题在发育/轨迹数据的背景下变得问题会严重的多，因为doublets看起来像是两种细胞类型之间的混合物，这可能会与中间细胞类型或细胞状态相混淆。

为了预测哪些“细胞”实际上是doublets，我们合成doublets（通过混合成千上万个单独细胞组合数据）。然后将这些合成的doublets投射到UMAP中，并识别它们的近邻。通过数千次重复这一过程，我们可以在数据中识别出和duoblets信号非常相似的“细胞”。

为了开发和验证ArchR的doublet识别，我们从10个基因不同的细胞系的混合pool中生成了scATAC-seq数据。在scATAC-seq中，这10个细胞系应该形成10个不同的clusters，但当我们故意过量增加10xGenomics的scATAC-seq反应，每个反应靶标25000个细胞，许多的doublets居然消失了。我们知道这些是doublets因为我们用 demuxlet 来识别含有来自两种不同细胞基因型的液滴。

在通过计算去除了doublets后，数据结构与我们预期的是符合的：

（三）代码操作：去除doublets

默认情况下，ArchR使用doublet 参数。我们鼓励所有用户检查去除前后的数据，以了解doublet 去除是如何影响细胞的。下面我们将展示一些主要的可调节的特性。

在ArchR中，使用addDoubletScores()在单个步骤中执行doublets移除。它会把推断的doublet分数添加到每个Arrow file 中，每个样品大概花大约2-5分钟来处理。你可以尝试使用?addDoubletScores来查看有关doublets识别参数的文档。

> doubScores <- addDoubletScores(
  input = ArrowFiles,
  k = 10, #Refers to how many cells near a "pseudo-doublet" to count.
  knnMethod = "UMAP", #Refers to the embedding to use for nearest neighbor search with doublet projection.
  LSIMethod = 1
)
#运行的时候会弹出很多信息：
ArchR logging to : ArchRLogs\ArchR-addDoubletScores-537c1086681d-Date-2020-11-18_Time-11-36-10.log
If there is an issue, please report to github with logFile!
2020-11-18 11:36:10 : Batch Execution w/ safelapply!, 0 mins elapsed.
2020-11-18 11:36:10 : scATAC_BMMC_R1 (1 of 3) :  Computing Doublet Statistics, 0 mins elapsed.
scATAC_BMMC_R1 (1 of 3) : UMAP Projection R^2 = 0.98315
2020-11-18 11:39:13 : scATAC_CD34_BMMC_R1 (2 of 3) :  Computing Doublet Statistics, 3.051 mins elapsed.
Biased Clusters : Cluster12 
scATAC_CD34_BMMC_R1 (2 of 3) : UMAP Projection R^2 = 0.9736
2020-11-18 11:41:26 : scATAC_PBMC_R1 (3 of 3) :  Computing Doublet Statistics, 5.266 mins elapsed.
scATAC_PBMC_R1 (3 of 3) : UMAP Projection R^2 = 0.97657
ArchR logging successful to : ArchRLogs\ArchR-addDoubletScores-537c1086681d-Date-2020-11-18_Time-11-36-10.log

在上面代码运行后的输出文件中，ArchR报告了每个Arrow file的UMAP投影的R2值。如果这些R2值非常低(比如小于0.9)，这通常表明Arrow file中的细胞具有很小的异质性。这使得doublets calling的准确性变差了，因为大多数的doublets都是“同型的”(homotypic)——或者是带有两个非常相似细胞的单个液滴。在这些情况下，我们建议跳过doublets预测。或者，你可以尝试设置knnMethod =“LSI”和force = TRUE（在LSI中执行投影）。但是，你应该手动评估结果，并确保其如你预期的那样执行。

添加doublets分数将在“QualityControl”文件夹中创建plot图。在每个样品文件夹中各有3个plots（实际上3个plot合并到了一个pdf文件里）:

1.Doublet Enrichments - 这些代表了在每个细胞附近的模拟doublets的富集程度，与我们的预期相比。
2.Doublet Scores - 代表了在每个单细胞附近模拟的doublets与预期相比的显著性(-log10(binomial adjusted p-value)) 。我们发现这个值与Doublet Enrichments不一样，所以使用Doublet Enrichments来进行doublets的鉴定。
3.Doublet Density - 表示doublets的密度，表示duoblet在二维空间的投影。

下面是三个样品的结果图：