饮食干预是促进健康老龄化的重要策略，在大多数模式生物和哺乳动物中，在营养均衡的前提下进行热量限制（CR）能够显著延长寿命，并延缓与年龄相关的疾病的发生，而CR在临床实验中的有效性是有限的，因为这种干预很难维持较长的时间，因此包括间歇性禁食等方案在内的限时进食（TRF）成为了替代方案。TRF最初没有特别进行热量限制，单纯延长两餐之间的禁食间隔，也能提供代谢性疾病的保护。人们对这些饮食干预对雄性小鼠的健康和生存益处进行了众多研究，但对雌性小鼠的影响知之甚少。

2023年7月，来自美国国立卫生研究院 (NIH) 的Rafael de Cabo研究团队在Cell Metabolism（IF=29）发表了题为“Prolonged fasting times reap greater geroprotective effects when combined with caloric restriction in adult female mice”的文章。本研究将雌性小鼠进行5种不同的喂食策略，分别研究热量限制（CR）和限时进食（TRF）对于雌性小鼠生理、疾病的进展和血清代谢组的影响，最终的结果表明热量限制和限时进食在不同程度上可以提高雌性小鼠的生存率，并且热量限制可以减少恶性肿瘤的进展和肺部炎症性疾病的严重程度，这为女性抗衰老相关研究提供了数据。

研究思路

研究结果

1. 不同组小鼠食物摄入和体重的变化模式

为了研究不同喂食方案对雌性小鼠的影响，作者将61周龄的雌性小鼠分为5组进行饮食干预，分别是AL（任意喂食）、TRF4（4小时限时喂食）、TRF8（8小时限时喂食）、CR（限制热量）和CR×2（限制热量并分2餐完成）。与AL相比，TRF小鼠在干预开始时食物摄入量较少，但随后不断接近甚至反超，各组小鼠体重（AL组体重开始24周持平）也不断减少（图1B、C），体脂并未发生显著变化（图1D）。但较AL相比，4个干预组的血糖水平明显下降（图1E）。在干预80周后，CR组的衰弱指数（FI）较其他组显著降低（图1I、J）。以上结果也说明了，热量限制相对与限时喂食对雌性小鼠的关键表型指标有更大的改善。

图1 喂食方式对雌性小鼠健康指标的影响

采用代谢室间接量热法研究了不同喂食方案对雌性小鼠体内代谢的影响。分别于干预后第17周和第69周收集数据，作者发现在第69周，4个干预组的体重减少量较AL组更多，并且食物摄入量明显低于AL组（图2A、B）。AL组的呼吸交换比（RER）波动较小，AL组和TRF组比CR组消耗了更多的食物，但RER波动更小，持续时间更短（图2D）。与17周数据相比，第69周AL组小鼠的RER波动说明了老年雌性小鼠较年轻雌性小鼠具有更低的体脂（图1D），因此需要消耗更多食物并增加碳水化合物氧化以支持能量需求和维持体温。

图2 喂食方案对雌性小鼠体内代谢功能的影响

2. 生存研究和组织病理学分析

与AL对照组相比，在中年雌性小鼠中进行CR干预能显著提高生存率 (图3A)，并且具有晚年效应。根据相对于中位寿命的死亡时间，将小鼠分为短寿命和长寿命。死亡时的组织病理学分析显示，大多数小鼠至少有一种肿瘤。而与寿命较短的小鼠相比，寿命较长的小鼠在死亡时非肿瘤性疾病的频率更高，这与喂食方案无关。对小鼠心脏、肺、肝和肾的尸检全切片图像进行深入的描述性和半定量分析，确定了每只小鼠的器官疾病负担评分。在长寿小鼠中，TRF8和CRx2小鼠相比AL有更高的综合疾病负担评分 (图3B)和单个器官（心脏、肝）评分。而在TRF8和CRx2小鼠中，长寿小鼠的评分更高（图3C）。与AL小鼠相比，CR小鼠表现肺炎症状相对较轻(图3D)。这些结果表明，即使是从中年开始，CR干预也可以减少恶性肿瘤的进展和肺部炎症性疾病的严重程度。

图3 生存分析和组织病理学

3. 代谢组学分析揭示了TRF和CR小鼠血清的不同特征

为了研究实验组之间健康寿命指标的差异是否与代谢重塑相关，作者对饮食干预26周的雌性小鼠进行了血清非靶向代谢组学研究。PLS-DA显示AL、TRF和CR间有明显分离（图4A），按VIP值大小排序前25个代谢物中脂质占比较大（图4C），而通过单变量统计显著性最高的25个代谢物中，在CR组中水平增加的代谢物也是脂质为主（图4B）相比之下，TRF干预并没有引起强烈的变化 (图4B和4C)。韦恩图分析显示CR.vs.AL的比较组中有27种与TRF.vs.AL不同的脂质（图4E），将这些脂质进行富集分析发现CR组中富集的脂类（胆汁酸、脂肪酰基肉碱等）与AL中（单酰基甘油、甘油磷脂）富集的显著不同（图4G）。除脂质外的代谢物也发现了CR和TRF之间存在显著差异（图4H-J），这说明了与AL相比，CR和TRF所导致的血清代谢组特征显著不同。

图4 饮食干预后雌性小鼠的血清代谢组特征

使用类似的分析方法评估CR和TRF不同组间的代谢差异，作者发现CR.vs.TRF特有的脂质和其他代谢物均较多(图5A、E)。富集分析也证实了CR与TRF4(图5C)以及CRx2与TRF8(图5D)之间脂质特征存在显著差异。富集分析表明，与CR相比，TRF4对Arg、Pro和Gly-Ser-Thr代谢的反应略有增加(图5G)。总之，这些数据表明，在长期进行CR和TRF后，由于热量限制的程度不同，动物对空腹刺激的反应和适应与血清代谢组有关 (图5H)。

图5 不同喂食方案的独特代谢组学特征

4. 营养干预的系统性影响及代谢特征

为了评估CR和TRF营养干预对维持健康和生存的能量成本的系统性影响，首先，作者将雌性小鼠的血清特征代谢物与热量限制程度、肌肉骨骼和表皮的衰弱指数等进行了聚类分析 (图6A-D)。热量限制得程度越高，能量摄入减少的百分比越高(图1C)，这导致代谢对脂质氧化的依赖性越高，这解释了它们在血清中的水平下降(图6A，第一列)，并且当热量限制程度增加时，CR要优于TRF对特征代谢物的干预(图6A)。骨骼肌肉与表皮呈相反的态势，前者主要由CR干预占主导，后者则是TRF干预占主导（图6C、D），而五种喂食方案的生理与代谢的PCA显示AL与干预组之间的明显差异，这有助于区分潜在的负责生理和血清代谢组变量（图6E、F）。

图6 生理和代谢特征的综合分析

总结

本研究中，作者通过生理指标、组织病理学分析结合血清代谢组学揭示了不同喂食方案对雌性小鼠的影响。结果显示热量限制和限时进食能在不同程度上影响雌性小鼠的体重、血糖和呼吸交换率等指标。生存分析显示热量限制确实可以提高雌性小鼠的生存率，并且减少恶性肿瘤的进展和肺部炎症性疾病的严重程度。代谢组学分析则为我们揭示了热量限制和限时进食之间所导致的不同代谢特征，与生理指标的进一步关联有助于我们将代谢特征与表型进一步关联，本研究也为热量限制和限时进食如何影响女性群体的健康提供了参考。

参考文献

Eleonora Duregon, Maria Emilia Fernandez, Jorge Martinez Romero, et al. Prolonged fasting times reap greater geroprotective effects when combined with caloric restriction in adult female mice [J]. Cell Metab, 2023, 35(7):1179-1194.