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南京傲因生物

供稿：黄立婷、常乐 、詹梦涛

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Highly Multiplexed Image Analysis of Intestinal Tissue Sections in Patients With Inflammatory Bowel Disease
多通路成像分析炎症性肠病患者的组织切片
期刊：Gastroenterology
IF：33.883 (1区Q1)
DOI ：10.1053/j.gastro.2021.08.055

01研究背景—————————————————————————

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）首次病例出现于1859年，经过多年研究，发病机制涉及遗传和环境因子。当前，主要的直接治疗方式靶向过度活跃的免疫反应。尽管如此，哪种免疫系统对IBD的发生和发展的理解尚不明确。其中一个挑战是IBD的异质性，简而言之，就是免疫细胞之间的相互作用。为理解是免疫细胞之间的相互作用，在本文中，作者使用多通路成像技术。选取6例无炎症的正常样本作为基准，以及6例溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）6例和克罗恩病（Crohn’s Disease, CD）。样本使用H&E染色，最终得到超过30万个独立细胞。
结果：IBD引起肠道上皮增殖和HLA-DR表达，以上两种现象与炎症有极大的正相关。临近分析表明T细胞相互作用CD68和CD4在两种IBD均有出现。
结论：IMC是一个强大的IBD分析平台。本文中，作者通过IMC详细描述了CD和UC患者的组织学特征和细胞谱，同时使用31种抗体同时分析上皮细胞、间质细胞和免疫细胞群。目的是通过进行高度多路图像分析表征IBD炎症环境的能力，包括上皮细胞增殖、钙粘蛋白表达、HLA-DR表达、免疫细胞组成和Treg在细胞间的相互作用。

02研究结果—————————————————————————

Imaging Mass Cytometry Captures Major Epithelial, Stromal, and Immune Cell Populations in Inflammatory Bowel Disease

IMC捕获IBD的主要上皮细胞、间质细胞、免疫细胞群

样本信息：6 CI 末端回肠; 6 CD 末端回肠; 6 CC 结肠; 6 UC 结肠
首先，作者用31种针对结构、上皮和免疫细胞类型的特异性抗体对组织切片进行染色，在过滤掉具有高、非特异性自身荧光信号的细胞并去除低质量图像后，从48张图像中获取了396,890个细胞。并通过Boolean方法一共鉴定到13个不同的细胞亚群，包括上皮细胞(epithelial cell)、αSMA+肌成纤维细胞(A.SMA+ cell)、间质细胞(stromal cell)、神经性粘附因子(NCAM)、CD8+ T细胞(CD8+ T cell)、CD4+ T细胞(CD4+ T cell)、调节性T细胞(regulatory T cell)、CD20+B细胞(CD20+ B cell)、浆细胞(plasma cell)、CD68+巨噬细胞(CD68+ macrophage)、CD14+单核细胞(CD14+ monocyte)、CD16+髓细胞(CD16+ myeloid cell)、CD11b+髓细胞(CD11b+ myeloid cell)（Fig 1）。

Fig 1.根据其蛋白表达谱，将分割的细胞注释为13种细胞类型

Histologic Assessment Reveals Variable Active and Chronic Inflammation Severity in Inflammatory Bowel Tissues

组织学评估显示炎症性肠组织存在不同程度的活动性和慢性炎症严重程度，由于不同患者的IBD表现不同，作者通过评估邻近HE染色切片的组织病理学特征，对48张图像进行了炎症分级。

Epithelial Proliferation and HLA-DR Expression Are Increased in Inflammatory Bowel Disease and Correlated With Severity of Inflammation

炎症性肠病中上皮增殖和HLA-DR表达增加，并与炎症的严重程度相关

通过量化Ki67上皮细胞的比例，比较CD与CI、UC与CC的增殖活性，观察到CD和UC的上皮细胞增殖均较各自的对照组增加。E-cadherin是维持上皮结构完整性所需的细胞黏附分子，因此上皮屏障功能下降是IBD发病的触发因素之一；HLA-DR是一种MHCⅡ类蛋白，正常表达于IBD上皮细胞可升高的抗原提呈细胞表面。研究二者的上皮表达水平是否改变，发现E-cadherin表达不变，HLA-DR在CD和UC上皮细胞较对照组明显升高（Fig 2A-E）。
研究上皮增殖率、E-cadherin表达、HLA-DR表达与炎症严重程度是否相关。发现UC结肠中炎症和非炎症的上皮增殖率相似，而CD回肠中上皮增殖率与炎症强度明显相关。此外，HLA-DR的表达与回肠和结肠炎症强度相关，比较同一患者不同程度炎症的图像时，也能够发现炎症与上皮增生/HLA-DR表达呈正相关（Fig 2F-J）。

Fig 2.IBD上皮细胞增殖和HLA - DR表达增加

Inflammatory Bowel Disease Tissues Exhibit Unique Immune Cell Profiles Based on Disease Type and Inflammation

炎症性肠病组织表现出基于疾病类型和炎症的独特免疫细胞谱

免疫细胞在IBD的发病中起重要作用，固有免疫和适应性免疫反应的过度激活导致黏膜组织的损伤。作者鉴定了主要的免疫细胞群，包括CD4+T辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞、Foxp3+ 调节性T细胞、CD20-/CD27+ / CD38+浆细胞、CD6+驻留巨噬细胞、CD14+单核细胞（Fig 1）。并对这些细胞类型进行量化，发现CD4+T细胞在CD中显著增加而UC中不明显，CD8+T细胞在不同疾病组中存在差异；CD68+巨噬细胞在正常肠道内呈稳态，且CD相较对照组增加；CD14+单核细胞、浆细胞和Treg在CD和UC均有增加，一般来说，三者在CD和UC中随着炎症程度的增加而增加（Fig 3A）。
根据免疫细胞组成谱对所有图像进行分层聚类，以在疾病组和炎症状态之间进行比较，显示(1)对照组与疾病图像分开聚类；(2)CD慢性炎症表现为CD4+T细胞和Treg频率增高；(3)UC慢性和活动性炎症的图像以浆细胞和CD14单核细胞频率增高为标志；(4)4张慢性炎症CD图像和2张慢性炎症和活动性炎症UC图像显示Tregs、浆细胞和CD14单核细胞增多（Fig 3B）。

Fig 3.IBD黏膜免疫细胞组成

Tissue-Resident Macrophages and CD8+ T Cells Exhibit Increased Inflammatory Activity in the Lamina Propria of Patients With Inflammatory Bowel Disease

组织驻留巨噬细胞和CD8+ T细胞在炎症性肠病患者的固有层中表现出增加的炎症活性

接下来，通过根据细胞状态和活性标志物的表达情况，对CD8+T细胞亚群和CD68+巨噬细胞亚群进行分析，来判断免疫细胞组成是否能够更好地可视化。
CD38在T淋巴细胞中的表达在炎症粘膜中已被证明增高，CD69是淋巴细胞短暂活化的标志之一，颗粒酶granzyme B是CD8+T细胞和其他免疫细胞表达的细胞毒性蛋白，可破坏感染宿主细胞。溶菌酶lysozyme C是小肠Paneth细胞为保护黏膜层免受外来病原体入侵而分泌的一种抗菌蛋白，但也是巨噬细胞在炎症环境中产生的，一旦被吞噬体中的细胞摄取，就会破坏病原体。
定量CD38+、CD69+和granzyme B+CD8+T细胞，显示在CD和UC中均表现为CD38+和granzyme B+CD8+T细胞增加，其他无变化（Fig 4A,C）。定量lysozyme C+和granzyme B+巨噬细胞，显示在CD和UC中均发现lysozyme C+巨噬细胞增加，而granzyme B+巨噬细胞仅在UC中增加（Fig 4A-D）。这些结果表明，CD8+T细胞和CD68+巨噬细胞这两种细胞类型均增加了IBD炎症和抗菌活性增强的标志物表达水平。

Fig 4.活化的CD68+巨噬细胞和CD8+T细胞在IBD中大量增加

Neighborhood Analysis Shows Selective Interactions of Regulatory T Cells With Immune Cell Populations

邻域分析显示调节性T细胞与免疫细胞群的选择性相互作用

利用IMC所保留的空间信息，作者希望确定Tregs（调节性T细胞）与某些免疫细胞类型的相互作用在各疾病组中是否发生频率高于预期。为此，进行了邻近分析来量化Foxp3+ Treg邻居间不同免疫细胞类型的富集情况。结果显示，在CD和UC中，与随机分布相比，CD68+巨噬细胞、CD4+T细胞和浆细胞的Tregs邻居均显著富集；而与CD14+单核细胞和CD8+T细胞邻居的Tregs，在CD中显著富集，UC中不富集（Fig 5A,C）。
最后，为了确定Tregs是否更容易与活化的免疫细胞亚群发生相互作用，作者在CD和UC中进行了以Tregs为中心同CD38+CD8+T细胞、CD38-CD8+T细胞、 lysozyme C+CD68+巨噬细胞以及lysozyme C-CD68+巨噬细胞的相互作用。研究发现，在CD中，Tregs与lysozyme C+CD68+巨噬细胞的相互作用显著高于lysozyme C-CD68+巨噬细胞，但在UC中这种作用并不成立。两组均未见与CD38+CD8+T细胞邻居的Tregs高于与CD38-CD8+T细胞邻居的富集（Fig 5B,C）。

Fig 5.IBD黏膜免疫细胞组成

[参考文献]
Kondo A, Ma S, Lee M Y Y, et al. Highly multiplexed image analysis of intestinal tissue sections in patients with inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology, 2021, 161(6): 1940-1952.