前言

植物基因组大小跨越几个数量级，倍性和杂合性变化，以及新旧基因组转座子变化等带来组装挑战。三代和物理图谱提供了新机会，单倍型定相、结构变异分析、从头泛基因组研究成为新兴组装热点。

植物基因组发展：

• 拟南芥：sanger BAC-by-BAC。
• shotgun OLC （CELERA assembler）：木瓜、大豆、杨树等早期测序植物。
• 454/Illumina DBG 短序列高深度带来植物基因组组装大爆发，但质量较低。
• 单分子PacBio长度长带来接近完整染色体组装。
• 辅助技术发展：Hi-C/BioNano（无需昂贵的BAC物理图谱）
• ONT纳米孔能达上Mb，组装拟南芥、番茄、高粱、香蕉、甘蓝等更连续和完整的版本。

在过去20年种，有400多个植物基因组已发表，包括333个被子植物，15个非被子植物、2个轮藻和44个绿藻。

可查阅：
https://www.plabipd.de/portal/web/guest/sequenced-plant-genomes

1. 单分子长度长测序

PacBio通过CCS产生HiFi 15 kb reads的方法准确率高达99.8％，解决了错误率问题，但每条read成本高了近5倍。

基因组测序的发展，在基因组完整度上已经有了很大提升。

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2. 长度长基因组组装的错误倾向

新算法的设计目的：correct, overlap, and polish long reads with high error-rates。
算法随计算设计、速度、内存使用、复杂基因组利用而变化。

• 自纠方法self-correction：CANU、Falcon（phase/unzip）、MARVEL、MECAT。利用reads相互比对，需要较高覆盖度。
• correction-free：基于OLC的minimap2/miniasm、基于DBG的wtdbg2和Flye。要求更高复杂度的基因组。

组装的草图有误差，必须用高覆盖度的长读长或短读长polish，一般大于三次可达到>99.6%的准确性。

• long reads：Quiver/Arrow (PacBio)、Medaka (ONT)、Nanopolish、Racon。
• short reads：Pilon

PacBio CCS HiFi软件：Peregrine

3. 物理图谱技术

• a.Hi-C

• b.Optical maps

  
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4. 解决复杂植物基因组

如下图，两条染色体组装时定相，杂合基因组phasing有如下方法：

• 右上：嵌合假分子，简化下游分析。
• 右中：原始reads比对到contigs，解决缺失的单倍型区域，建立一个定相的二倍体组装。

• 右下：保留部分单倍型，并在基于图的组装中加以标记。

  
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5. 利用组装图

组装经典指标是N50，或者最短序列长度大于组装的50%，方法过于简单。
利用组装图可以可视化复杂度和邻接contig的overlap。

• 纯合简单基因组（左上图）：理想的graph对于每个contig（节点）只有一条边和邻接序列相连。
• 气泡图（左下图）：高杂合性，节点（单倍型）被多条边连接。
• 复杂重复（右上图）：在图结构中较模糊，如rRNA,centromeric satellite DNA。

• 毛团（hairballs，右下图）：多拷贝重复，无清晰路径，节点互交。

  
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当参考基因组被泛基因组取代时，基因组图论将是代表复杂基因组更好的方法。

挑战和展望

挑战：

• 多倍体和杂合度

展望：

• 基因组完整、少gap、定相。
• denovo替代重测序，挖掘更多多样性，用于群体遗传和泛基因组分析。
• 基因组注释将落后于组装，提高注释质量需要新技术（如全长cDNA，PacBio Iso-seq等）以及新算法。

参考文献：Todd PMichael. Building near-complete plant genomes. Curr Opin Plant Biol. 2020 Apr;54:26-33.