10X空间转录组研究发现空间上不同的 THY1 阳性细胞的亚克隆

昨天元宵，就算是把年过完了，我们又要开始一年的奔波了，有的时候我真的想问一句，去年过的并不算很好，能不能退我一岁？😄，莫泊桑曾说过，生活不可能像你想得那么好，但也不会像你想的那么遭~~~，这一篇分享的文献在Subclonal evolution and expansion of spatially distinct THY1-positive cells is associated with recurrence in glioblastoma，我们来看看胶质母细胞瘤复发的空间克隆研究。

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文章思路

研究目的

胶质母细胞瘤（GBM）是一种以不可避免的复发为特征的致命疾病。 在这里，研究了介导耐药性的分子途径，目的是确定针对这种肿瘤的治疗机会。

实验设计

开发了一种纵向体内复发模型，利用患者衍生的外植体在替莫唑胺 (TMZ) 和放射 (IR) 后产生配对标本（复发前和复发后）。 评估这些样本的治疗反应并确定驱动治疗抗性的基因表达途径。 使用 GBM 的空间转录组学对研究结果进行了临床验证（空间转录组已经开始做临床验证了）。

研究成果

These studies reveal in replicate cohorts, a gene expression profile characterized by upregulation of mesenchymal and stem-like genes at recurrence。对临床数据库的分析显示，这种转录谱的表达增加与中位总生存期较差（248 天 vs 430 天，p=0.0004）显著相关，并且复发时该谱的上调。最值得注意的是，发现了 TGFβ 信号的上调，以及复发时 THY1 水平增加了一百多倍。利用细胞分选，观察到 THY1 阳性细胞在初治肿瘤中占不到 10% 的细胞，在复发性肿瘤中占 75-96%。然后，从未接受过治疗的患者样本中分离出 THY1 阳性细胞，并确定它们在原位模型中对放化疗具有固有的抵抗力。此外，使用来自未经治疗的 GBM 的图像引导活检，进行了空间转录组分析。空间转录组揭示了以间充质/干细胞样基因表达为特征的罕见 THY1+ 区域，类似于复发性小鼠模型样本，其与血管周围生态位内的巨噬细胞共定位。由于 TGFβ 信号传导有助于间充质/干细胞样表型，在体内抑制 TGFβ RI 活性，导致间充质/干细胞样蛋白水平降低，包括 THY1，并恢复复发性肿瘤对 TMZ/IR 的敏感性。

结论

这些发现表明，GBM 复发可能是由于血管周围生态位内预先存在的、治疗抗性的、THY1 阳性、间充质/干细胞样细胞的肿瘤再增殖引起的。 此外，数据证明了靶向抗性亚克隆中上调途径作为实现治疗反应的新机制的前景，特别是 THY1 表达可能代表对 TGFβ 抑制反应的生物标志物。

详细看看全文，这一篇主要是运用空间转录组进行临床验证，非常棒，如果空间转录组走向临床，前景非常广阔

INTRODUCTION

胶质母细胞瘤 (GBM) 是最常见的原发性脑实质内肿瘤，是一种中位生存期为 15 个月的致命疾病，其特点是治疗抵抗、侵袭性脑部侵袭和不可避免的复发，不到 10% 的患者存活超过 5 年.导致快速复发和缺乏有效治疗的主要障碍是 GBM 明显的肿瘤内和肿瘤间异质性。此外，鉴于 GBM 中存在的异质性，人们假设先前存在的抗治疗亚克隆的进化和扩展通常是不可避免的复发的原因。在细胞和微环境水平上都可以看到瘤内异质性。在肿瘤微环境水平上，不同的生态位，尤其是血管周围、缺氧和侵袭性肿瘤生态位，已被证明富含抗治疗癌症干细胞 (CSC) 群，也被描述为复发启动干细胞。这些预先存在的 CSC 群体被认为在驱动治疗耐药性方面发挥着关键作用，其特点是自我更新、分化以及治疗后扩大和重新填充肿瘤的能力。缺乏关于预先存在的抗治疗癌症干细胞在逃避化学放射治疗中的作用以及这种表型的机制基础的确切证据。了解治疗耐药表型的遗传基础应该为治疗干预提供机会，以降低 GBM 的复发率。

在这项工作中，利用了使用源自患者的 GBM 外植体开发的纵向小鼠模型来概括临床治疗范例。使用该模型，从每只实验小鼠中生成了预处理和复发配对样本，目的是识别差异表达的基因，这些基因应该为肿瘤复发提供分子基础。对多个重复颅内患者衍生异种移植物 (PDX) 的系统分析显示，复发性肿瘤的特征在于具有间充质和 CSC 特征的基因表达模式特征，其中包括 THY1/CD90、TGFβ1、TGFβ2、SOX2、ZEB2 和 GLI2 的上调.与之前的观察结果一致，使用大型 GBM 队列证明该基因表达谱与较差的总体预后相关，突出了研究结果的临床意义。为了检验肿瘤复发可能归因于以该基因表达特征为特征的预先存在的细胞群的假设，对来自未接受治疗的患者样本的 THY1+ 细胞进行免疫分选，并证明颅内肿瘤来源于 THY1+ 细胞（Pre-THY1+）与未分类的肿瘤相比，它们具有固有的治疗抗性。这些结果表明，在最初的初治肿瘤中可以发现具有不同基因表达谱的罕见的固有治疗抗性细胞群，并导致肿瘤复发。作为支持，用逆转间充质基因表达特征的靶向药物治疗肿瘤，导致对放化疗的敏感性恢复。此外，human GBM 标本的空间转录组分析一致地确定了 THY1+ 细胞与间充质、胶质瘤干细胞和巨噬细胞基因特征的表达共定位，并且主要在血管周围的生态位中发现。这表明这些罕见的耐药细胞在血管肿瘤微环境中的重要作用。

Spatial transcriptomics的分析

获得的人体样本立即在液氮/异戊烷中冷冻，然后将它们嵌入最佳切割温度的化合物中并冷冻。将组织切片到 Visium Spatial Gene Expression Slide (10X Genomics) 上并透化以释放 mRNA 以与空间条形码捕获探针结合。这用于合成 cDNA，然后制备测序文库和测序。使用 Vslide (v1.1.115, MetaSystems GmbH) 对测序数据进行可视化并将生成的图像放在一起。使用 10X genomics软件（Space Ranger 和 Loupe Browser）对样本数据进行成像和分析。使用 Load10x_Spatial 函数将 SpaceRanger 输出文件导入 R。使用 SCTransform 函数对这些点进行库大小标准化，控制在每个点表达的线粒体基因的百分比。在使用 PCA 和 UMAP 进行降维之前，使用 MAGIC 估算基因计数以平滑数据。具体来说，主成分是使用插补后的top变量基因计算的，前 30 个主成分的数据嵌入用于识别集群和学习 UMAP 嵌入。通过从 MSigDb 以及其他数据集中整理感兴趣的特定基因集，准备了基因集集合对象。富集分数是根据 MAGIC 估算的计数数据计算的。基于平均表达将所有基因分组到30个bin中。在每个给定的基因组中，每个基因的平均表达与来自相应bin的一百个其他随机采样基因作为靶基因一起计算。在每个点计算感兴趣的靶基因与对照基因的平均表达差异，以计算富集分数。在计算每个点的基因集的富集分数后，生成了通路分数与 THY1 表达的散点图，并计算了控制 G1.S 细胞周期分数的两者之间的 Spearman 偏相关性，以解释细胞的变化整个组织切片的活力。为了确定 THY1 表达和通路活性之间的空间重叠，对每个点进行了区域 Fisher 精确检验。基于 THY1 表达和通路评分，将数据二值化为第 75 个分位数的 THY1 阳性和通路阳性。然后，检查了每个点的 k=25 最近邻，并进行了 Fisher 精确检验以确定这两个特征是否存在显著重叠，即，pathway scores是否恰好在 THY1 阳性区域特别丰富。然后将 Fisher 检验 p 值叠加到组织切片上的每个spot上，以可视化在两个特征中具有显著重叠的区域。

RESULTS

in vivo modeling recapitulates therapeutic response to TMZ/IR followed by recurrence

为了评估 GBM 中对标准护理治疗 (TMZ/IR) 的治疗反应和潜在遗传基础，在颅内异种移植物中使用了患者来源的外植体。每周进行磁共振成像以监测植入后的肿瘤生长情况。携带约 20mm³ 肿瘤的小鼠被随机分为三个研究组。第一个代表未经治疗的对照动物，第二个队列同时用 TMZ/IR 治疗两周。第三组同时给予 TMZ/IR 2 周，然后每周 3 次辅助 TMZ，在完成第二周 TMZ/IR 后每隔一周。该实验设计旨在研究对标准护理疗法的抵抗机制。与肿瘤体积增加超过 300% 并在第三周死于疾病的对照动物相比，TMZ/IR 治疗的动物表现出最初的肿瘤消退并存活超过六周。接受 TMZ 佐剂的小鼠表现出更大的肿瘤生长延迟，并且存活时间延长（>12 周）。尽管对治疗有初步反应，但所有接受治疗的动物都有复发.

为了更好地了解治疗耐药性发展的潜在遗传基础，在开始治疗之前，使用 MRI 引导的立体定向颅内活检从动物身上获取肿瘤组织。 这种活检程序不会显著影响大体肿瘤结构。 在复发时也从这些动物获得活的肿瘤组织。 收集配对的预处理和复发肿瘤样本用于进一步分析。

Recurrent tumors are distinctly resistant to TMZ/IR

为了评估复发性肿瘤对治疗的敏感性，将来自治疗前和复发性活检的配对神经球培养物经颅内和皮下植入免疫缺陷小鼠。将具有可触及肿瘤的皮下植入小鼠模型随机分为对照组或用 TMZ/IR 治疗两周，然后如上所述辅助 TMZ。在没有治疗的情况下，通过活检获得的治疗前和复发性肿瘤都以相似的速度生长。作为对 TMZ/IR 的响应，治疗前的肿瘤表现出显著的肿瘤生长延迟（类似于最初的患者来源的肿瘤），并且肿瘤体积减少了 50%。然而，来自复发性活检的肿瘤继续表现出对 TMZ/IR 的耐药性，并且肿瘤体积增加了 750%。为了在适当的肿瘤微环境中确认这些发现，使用相同的配对神经球建立颅内肿瘤。与来自治疗前样本的小鼠相比，用 TMZ/IR 加辅助 TMZ 治疗患有颅内复发性肿瘤的小鼠证明了它们对治疗的抵抗力。作为支持，携带复发性肿瘤的小鼠的中位生存期为 7 周，而未经治疗的肿瘤为 11.9 周（p=0.006）

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Recurrent tumors develop a therapeutic resistant phenotype with increased mesenchymal and stem cell gene expression patterns and THY1 upregulation（复发性肿瘤发展为具有增加的间充质和干细胞基因表达模式以及 THY1 上调的治疗抗性表型 ）

为了描述在复发样本中观察到的治疗抗性的潜在基因组基础，使用 RNAseq 对来自同一主题动物的治疗前和复发活检的至少三个独立重复进行了转录组分析。 发现1159个基因存在差异表达（FDR<0.05）。 在这些差异表达基因中，645 个基因在复发性肿瘤样本中上调，而 514 个基因下调。 无监督聚类分析显示在多个重复中预处理和复发肿瘤的不同转录组学特征。 此外，每个治疗前样本的转录组与原始患者衍生的神经球培养物的转录组非常相似，这表明基因表达谱在体外扩增或颅内植入后没有drift significantly。

接下来，使用用于注释、可视化和集成发现的数据库 (DAVID) 进行了基因GO分析，以识别富含 TMZ/IR 抗性肿瘤的细胞过程。 复发性肿瘤显示出改变的生物学过程，如 20 个上调和 13 个下调的功能clusters（FDR<0.05）。 这些clusters被进一步合并以产生一组非冗余的 10 个上调基因clusters和 7 个下调基因clusters。 在七个下调的clusters中，六个与细胞凋亡和细胞死亡有关。 参与细胞粘附、神经元分化/发育和细胞形态发生的基因在上调的clusters中占主导地位。 特别地，复发性肿瘤过表达与细胞粘附相关的基因（例如 ITGB3、ITGB5、ITGB8、NEDD9、FBLN7、NLGN2、CADM1 和 VCAN）以及与间充质表型相关的基因（TGFΒ2、TGFΒ1、THY1)。

发现该基因表达特征的上调与治疗抗性表型相关，如临床数据库中较差的预后所示。基于前 64 个细胞粘附基因的平均基因表达水平创建meta基因评分。从 TCGA 数据库中选择接受 TMZ 和 IR 治疗的 GBM 患者，并根据 metagene 评分对他们进行排名。比较了 metagene 评分高的患者（所选患者总数的 1/3 以上）和 metagene 评分低的患者（所选患者总数的 1/3 以下）的无进展生存期和总生存期。如下图所示，具有高 metagene 评分的患者的临床结果较差，无论是在中位无进展生存期（260 天与 189 天相比，p=0.0003）还是中位总生存期（中位生存期为 430 天与248 天，p = 0.0004)。该分析证实了从实验小鼠模型中的观察结果，即实验观察到的特征的增加与患者的治疗抗性相关。

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为了探索与细胞粘附、间充质和干细胞表型相关的基因在 TMZ/IR 抗性中的作用，我们首先验证了从 RNAseq 分析中选择的基因（ZEB2、VCAN、CDK6、THY1、GLI2、SOX2），这些基因以前与治疗相关 GBM 中的耐药性。 定量 PCR 分析证实 ZEB2、VCAN、CDK6、THY1、GLI2 和 SOX2 mRNA 水平在所有四个复发性肿瘤样本中与未接受治疗的对应物相比上调。 蛋白质印迹分析证实，与未处理的对应物相比，大多数复发样本中每个基因的蛋白质水平也有所增加。 CD133 细胞表面表位（胶质瘤干性的标志物）的表达在四种复发性肿瘤中的三种中也显著升高。

与在重复复发肿瘤之间观察到的基因表达的这些一致变化相反，对每个预处理和复发样本之间的拷贝数增加或拷贝数丢失的分析没有显示任何显著和一致的变化。这表明耐药性的发展表型是由基因表达变化而不是基因组变化引起的，突出了调节已确定的相关细胞信号通路的重要性。

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Inhibition of TGFβ signaling decreases THY1 expression, reverses the mesenchymal resistance phenotype, and results in improved treatment sensitivity in vivo

在复发性肿瘤中，耐药表型的特征是间充质和 CSC 基因的表达增加。具体而言，TGFβ途径也显著上调。事实上，复发性肿瘤中的许多（63 个中的 21 个）上调基因与 TGFβ 信号通路直接或间接相关。 TGFβ被认为是上皮间质转化的主要调节因子。为了评估 TGFβ 信号传导与上调基因表达谱和 TMZ/IR 抗性的关联，使用了 TGFβR1 丝氨酸苏氨酸激酶抑制剂。患有来自预处理 (P2) 和复发性肿瘤 (R1) 的侧腹肿瘤的动物被随机分为四组：1) 对照组（未治疗），2) TMZ/IR 治疗，3) 单独使用 TGFβ 抑制剂治疗 (LY2109761) , 和 4) 用 TMZ/IR 和 LY2109761 的组合治疗。未经处理的肿瘤样本（P2 和 R1）以及经处理的复发性肿瘤样本（RT1-5）的蛋白质印迹分析显示，与未经处理的肿瘤相比，用 LY2109761 治疗肿瘤导致 THY1、ZEB2、CDK6、SOX2 和 GLI2 的水平降低复发性肿瘤。此外，这些间充质/干表型标志物在接受 TMZ/IR 和同时接受 LY2109761 的肿瘤中也下调。这些发现表明 LY2109761 适当地靶向了GBM 模型中预期的感兴趣的途径。

LY2109761 单药治疗并未显著减缓肿瘤生长。 然而，与单药 LY2109761 或 TMZ/IR 治疗相比，将 LY2109761 与 TMZ/IR 联合使用可显著降低肿瘤生长。 这些发现表明 TGFβ 介导的间充质和干细胞样基因表达谱激活促进了对 TMZ/IR 的抗性，并且 TGFβ 抑制下调间充质和干细胞样表型恢复对 TMZ/IR 的敏感性。

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Rare THY1+ cell populations derived from treatment naive GBM are inherently TMZ/IR resistant, and repopulate the recurrent tumors

上述发现 THY1 转录物和蛋白质水平在复发肿瘤样本中上调（与未治疗样本相比超过 100 倍），结合观察到 LY2109761 治疗导致 THY1 表达降低并恢复复发肿瘤对TMZ/IR，促使进一步研究 THY1。在人类癌症中，THY1 与预后不良有关，与癌症干细胞有关，并在粘附、侵袭、转移、免疫逃避和上皮间质转化中发挥作用。鉴于 THY1 表达与治疗抗性和间充质特征的关联、其在复发性肿瘤样本中的显著上调以及其作为细胞表面标志物的地位，定量评估了 THY1+ 细胞在肿瘤中的存在。在未经治疗的肿瘤活检中，观察到 THY1+ 细胞占比 6-10%。相比之下，复发性肿瘤中 75-96% 的细胞是 THY1+。 FACS 从预处理样品 (Pre-THY1+) 中分离和扩增 THY1+ 细胞，证实它们保留了细胞表面 THY1 的表达。然后将 Pre-THY1+ 细胞颅内植入裸鼠并用 TMZ/IR 处理。这些实验表明，Pre-THY1+ 细胞实际上在一定程度上具有与复发性肿瘤相似的固有治疗抗性。此外，携带使用 Pre-THY1+ 细胞衍生的颅内肿瘤的小鼠的存活率与携带源自复发细胞的肿瘤的小鼠相似。This finding, combined with the consistent observation that each of the recurrent tumors (R1-R4) exhibited an enrichment of THY1+ cells when compared to their respective pre-treatment biopsy (P1-P3) suggests that THY1+ cells represented a treatment recalcitrant cell population within the treatment-naïve tumors. These cells have stem cell like features with a mesenchymal phenotype, and likely survive therapeutic intervention and repopulate the tumor.

为了评估上调的 THY1 的临床意义及其与治疗抗性的关联，分析了来自 GLASS 联盟和其他临床数据库的配对人类 GBM 标本，这些标本显示 THY1 基因表达在大多数复发性肿瘤中显著上调。 对 TCGA 数据库的分析表明，高 THY1 表达与显著更差的无进展生存期和总生存期相关。 这些发现表明我们的模型与临床情况相似，并进一步强调了 THY1 在 TMZ/IR 抗性发展中的作用，并表明表达 THY1 的 GBM 细胞的克隆扩增可能有助于 TMZ/IR 抗性。

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THY1 expression in human GBM is spatial niche-dependent

体内研究表明 THY1 表达与治疗耐药性和干细胞和间充质基因表达特征相关，结合最近的研究表明 THY1+ 细胞通常存在于血管周围或干细胞生态位内，并与间充质和干细胞基因表达相关模式，促使评估 THY1 表达细胞在患者来源的 GBM 肿瘤组织中的空间分布。来自高灌注区域（即高血管分布）的图像引导术中人类 GBM 活检的空间定量全转录组分析（空间转录组学）显示 THY1 表达显著共定位于血管周围生态位，其特征在于共表达胶质瘤干细胞和间充质特征，以及 TGFβ 信号传导。还对源自低灌注区域的活检进行了空间转录组学。该分析还表明，THY1 在血管周围生态位内表达，并与间充质和干细胞特征显著共定位，TGFβ 信号传导上调。

由于已知肿瘤相关巨噬细胞会驱动恶性生长、干细胞维持和上皮间质转化 (EMT)，我们分析了我们的空间转录组数据，结果显示 THY1 也始终与巨噬细胞基因表达谱共定位。 然后，我们对 THY1 高与低区域进行了基因本体通路富集分析，结果显示细胞粘附和细胞外基质通路在高血管和低血管样品中富含 THY1 的区域中高度上调，支持我们的体内分析。 这些数据表明，THY1+ 细胞始终定位在一个共同的生态位内，这表明在肿瘤微环境中的信号轴中发挥关键作用，这有助于维持导致治疗抗性的间充质和癌症干细胞表型。

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DISCUSSION

尽管采用最大安全切除和 TMZ/IR 对 GBM 进行了积极治疗，但复发是不可避免的，驱动耐药的治疗可行机制尚未确定。 为了表征 GBM 治疗耐药性发展的分子基础，开发并分析了临床前体内复发模型以及患者衍生活检的空间分析。 所描述研究的一个重要发现表明，在未经治疗的 GBM 中，少数预先存在的、抗治疗的肿瘤细胞可能会导致肿瘤复发。 具体来说，这种 THY1+ 细胞群位于血管周围的肿瘤生态位中，强烈表达 EMT 和干细胞特征，并与巨噬细胞共定位。 研究结果还表明，在驱动间充质转化的血管周围肿瘤微环境中，表达 THY1 的细胞和巨噬细胞之间的关键细胞间相互作用可能导致肿瘤复发。

我们开发的 GBM 复发模型概括了临床治疗范式，并在复发时产生了高度耐药的肿瘤。最值得注意的是，与治疗前活检相比，复发活检中 THY1 的表达增加了 100 倍以上。然后，使用 THY1 作为细胞表面标记物，从未接受过治疗的肿瘤中分离出一群细胞，这些细胞概括了复发肿瘤样本的治疗抗性表型。这些结果的生物学意义和临床相关性通过以下发现得到进一步强调：THY1 表达在大多数患者复发时显著上调，并且 THY1 表达增加与更差的无进展生存期和总生存期相关。尽管之前已经描述了 GBM 中预先存在的抗治疗细胞的克隆选择，但这里提出的研究结果为这一概念提供了强有力的证明，并确定了表征该细胞群的特定表型和基因表达谱。

来自同一只小鼠的重复配对预处理和复发肿瘤的基因表达分析表明，耐药表型的发展也与间充质转化、干性、细胞粘附和细胞外基质成分相关基因的表达升高有关，以及与细胞死亡相关的基因下调。间充质基因表达特征源于上皮-间质转化 (EMT) 的生物学过程，其特点是在许多恶性肿瘤中侵袭和转移的能力增强。在这里，我们将 THY1 提名为最
在 GBM 中获得具有干细胞特性的间充质表型的细胞中的膜蛋白显著上调。 THY1 是一种细胞表面受体，已在几种非病理细胞类型中被鉴定出来，对细胞间通讯以及细胞-基质相互作用至关重要，从而导致许多生理过程，包括增殖、粘附和迁移。 THY1 已在多种恶性肿瘤中被发现，包括肾细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺肿瘤，并且与侵袭、转移、免疫逃避和预后不良有关，所有这些都是 EMT 的标志。

来自同一只小鼠的重复配对预处理和复发肿瘤的基因表达分析表明，耐药表型的发展也与间充质转化、干性、细胞粘附和细胞外基质成分相关基因的表达升高有关，以及与细胞死亡相关的基因下调。间充质基因表达特征源于上皮-间质转化 (EMT) 的生物学过程，其特点是在许多恶性肿瘤中侵袭和转移的能力增强。在这里，我们将 THY1 提名为细胞中最显著上调的膜蛋白之一，在 GBM 中获得具有干细胞特性的间充质表型。 THY1 是一种细胞表面受体，已在几种非病理细胞类型中被鉴定出来，对细胞间通讯以及细胞-基质相互作用至关重要，从而导致许多生理过程，包括增殖、粘附和迁移。 THY1 已在多种恶性肿瘤中被发现，包括肾细胞癌、乳腺癌、肝细胞癌、卵巢癌和胰腺肿瘤，并且与侵袭、转移、免疫逃避和预后不良有关，所有这些都是 EMT 的标志。

在我们的配对体内分析中，具有 THY1 上调的复发样本也显著增加了与细胞形态发生、细胞 - 细胞接触以及细胞粘附和细胞外结构组织相关的基因的表达。 我们对人类 GBM 标本的基因本体通路富集分析证实了这些结果。 这些细胞通路介导生长、迁移、存活、分化和抗细胞死亡的信号。 Avril 等人证明 THY1/CD90+ 肿瘤与侵袭性和多灶性肿瘤呈现的相关性增加。 这些研究进一步支持了 THY1 在细胞间通讯和迁移介导治疗抗性中的作用。

胶质母细胞瘤的治疗耐药性是由细胞和微环境水平上显著的肿瘤间和肿瘤内异质性驱动的。在肿瘤微环境 (TME) 的背景下，不同的肿瘤生态位，特别是血管周围、缺氧和侵袭性肿瘤生态位，已被证明富含抗治疗的癌症干细胞群。这些生态位支持耐药群体并在肿瘤复发中发挥关键作用，因为治疗难治细胞和邻近细胞（包括免疫细胞、基质细胞、分化癌、神经胶质细胞、神经元和内皮细胞）之间的相互作用驱动静止、侵袭、免疫抑制以及促进治疗抵抗的其他特征。为了靶向这些干细胞样、抗治疗细胞，需要更好地了解在局部 TME 环境中促进抗性表型的信号级联。最近开发的空间转录组学 (ST) 技术提供了原位询问整个转录组表达分析的能力，从而可以评估局部肿瘤微环境。由于强有力且可重复的证据表明 THY1 阳性可作为治疗抗性表型的标志物，因此可作为空间标志，我们对患者来源的 GBM 的图像引导活检进行了 ST 分析。该分析以无监督和空间幼稚的方式进行，然后将基因表达数据叠加到原始 H+E 成像上。我们发现，在对单个 GBM 的高灌注和低灌注区域的分析中，THY1 表达始终与间充质和茎样特征共同定位，并且主要在血管周围生态位中发现，验证了我们在小鼠模型中的研究。此外，我们的 ST 研究揭示了 THY1 表达与巨噬细胞基因表达特征的共定位。肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 已被证明可以维持干细胞群，并通过多种相互作用促进侵袭性和免疫逃避。例如，在乳腺癌中，TAM 被证明优先渗入 THY1+ 区域，结合癌症干细胞上的 THY1 受体，从而导致近分泌信号促进侵袭性和支持干细胞生态位，激活 SRC 和 NFκB 信号级联。这些研究进一步表明巨噬细胞的消耗导致肿瘤生长的停滞。在神经胶质瘤中，最近的一项研究表明，THY1 表达增加与 SRC 磷酸化相关，并导致 SRC 抑制剂达沙替尼抑制 SRC 依赖性肿瘤细胞迁移以及细胞-基质相互作用。有趣的是，最近的一项研究发现，局部 THY1+ 间充质干细胞通过增加肿瘤增殖和细胞迁移来诱导胶质瘤进展。我们的数据与现有文献相结合，强调了 TME 内细胞间相互作用在肿瘤进展中的重要性以及 THY1 在其局部生态位内旁分泌/近分泌信号传导中的关键作用。

我们的体内复发性肿瘤显示出具有 TGFβ 通路激活特征的间充质基因表达谱，这通过我们的患者来源组织的 ST 分析得到了进一步验证。许多研究已经独立地证明了 TGFβ 信号传导在小鼠模型中的治疗抗性、干细胞标志物的表达、神经球形成能力以及致瘤潜力中的作用。此外，抑制 TGFβ 信号传导与乳腺癌、白血病和胶质母细胞瘤中干细胞群的消耗有关。我们的研究结果支持这一点，因为使用 LY2109761 抑制 TGFβ 信号传导会降低间充质和干细胞样基因的表达。此外，用 LY2109761 治疗复发性肿瘤恢复了对 TMZ/IR 的敏感性。重要的是，尽管 LY2109761 作为单一药物的疗效最低，但我们观察到当两种方式结合使用时，对标准护理 TMZ/IR 的敏感性显著恢复。如前所述，这一发现直接暗示 TGFβ 信号通路在赋予间充质、干细胞样、治疗抗性表型方面。最近调查各种 TGFβ 抑制剂的临床试验没有显示出前景，但通常单独使用 TGFβ 抑制剂或与其他药物（包括洛莫司汀）联合使用。然而，我们的研究结果表明，TGFβ 抑制可能在复发环境中最有效地逆转对 TMZ/IR 的抗性，特别是如果患者富含此处描述的间充质和干细胞样特征的表达。特定的耐药途径可能只发生在患者亚群中，Wang 等人证实了这一点，他们在 11% 的复发患者中发现了 LTBP4（一种已知的 TGFβ 途径激活剂）的突变。因此，确定可能受益于 TGFβ 靶向的患者亚组至关重要。 TGFβ信号通路和间充质表型的激活也与修复DNA损伤的能力增强有关，从而通过几种转录因子导致化学和放射抗性。例如，在我们的复发样本中上调的 ZEB2 已被证明会影响 DNA 损伤后的 ATM/ATR 活性。其同源物 ZEB1，通过调节 CHK1 的稳定性来促进乳腺癌的放射抗性，并通过调节胶质母细胞瘤中的 MGMT 来调节 TMZ 敏感性。

复发的发展是一个鲜为人知的动态过程。 许多人认为，治疗期间的进化压力导致克隆细胞的选择与亚克隆细胞群的扩增和突变。 我们的研究结果表明，预先存在的肿瘤细胞亚克隆群的进化和生长也可能导致复发。 Chowell 等人证明，未经治疗的肿瘤通常含有罕见的抗治疗亚克隆，而这些亚克隆是标准检测无法检测到的。 Kim 等人的一项研究发现，肿瘤复发的遗传途径可能是独特的，并且在检查时难以预测
跨越多个样本。 其他人已经证明来自单个肿瘤的各种亚克隆可以在体外表现出不同的治疗反应，并断言该信息可用于预测临床反应。

最后，我们的研究提供了一种独特的临床相关小鼠模型来研究 GBM 的治疗抗性，并定义了一种稀有细胞群，表达对 TMZ/IR 治疗具有内在抗性的 THY1。这种方法为探索肿瘤耐药机制和对患者护理至关重要的治疗干预提供了独特的机会。尽管体内免疫功能低下的小鼠模型不能完美地复制临床范例或人类肿瘤微环境，但我们的研究结果已得到临床研究结果的验证。此外，我们的人类空间转录组分析为人类肿瘤细胞与肿瘤微环境之间的相互作用提供了额外的见解。在颅内小鼠模型中使用患者衍生的外植体而不是永生化细胞系来评估对联合治疗的耐药性的演变，使用基因组范围的基因表达分析也提供了我们的研究结果接近临床环境的信心。与临床经验一致，我们的结果表明辅助TMZ将总生存期从7周延长至13周。动物在接受 TMZ 辅助治疗时出现复发表明肿瘤确实具有抗药性。此外，在重新植入复发性肿瘤组织时重现了对 TMZ/IR 的抗性的证明证实了这一结论。需要进一步努力来确定固有抗性细胞如何通过血管周围生态位内的相互作用来驱动复发，这可能导致确定靶向临床益处的途径。在这里描述的复发模型中，我们利用 TMZ/IR 的组合来评估治疗抵抗的机制。尽管 TMZ 和 IR 的组合是 GBM 患者的标准治疗方法，但许多报告仅使用单一方式测试了 GBM 耐药性的分子基础，这虽然很重要，但并未模仿临床环境中耐药性的出现。

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