从分子角度加强对血小板串扰的认识，有利于肝癌患者的预后评估

Genetic Analysis of Platelet-Related Genes in Hepatocellular Carcinoma Reveals a Novel Prognostic Signature and Determines PRKCD as the Potential Molecular Bridge

肝细胞癌中血小板相关基因的遗传分析揭示了一种新的预后特征并确定PRKCD为潜在的分子桥梁

发表期刊：Biol Proced Online

发表日期：2022 Dec 3

影响因子：7.717

DOI:  10.1186/s12575-022-00185-9

一、研究背景

        HCC作为原发性肝癌的主要类型，目前仍然是全球公共卫生管理的一个严重挑战。虽然根治性手术和微创治疗大大改善了早期HCC患者的预后，但大多数人被诊断时已经是不适合手术的晚期，而且由于各地区预防意识和医疗资源的差异，HCC患者的整体预后也有明显的差异。

        血小板的异常变化可以通过多样化的机制介导肿瘤恶性进展和化疗耐药，这是一个长期存在且被广泛认可的概念。一般来说，血小板计数的异常增加被认为有助于多种隐匿性恶性肿瘤的早期诊断，也可以作为接受相应治疗的患者生存率的有力预测指标加以利用。

二、材料与方法

1、数据来源

1） 在TCGA-CIHC队列中提取了370个具有完整生存和病理数据的HCC病例作为训练集

2） GSE14520队列中的221个HCC病例和ICGC-LIRI队列中的227个病例具有可用的表达数据和临床信息，作为外部独立验证数据集

3） 300个与血小板生物学功能相关的血小板相关基因（PRGs）

4） 两种人类HCC细胞系，包括HepG2和MHCC97H

2、分析流程

流程图

三、实验结果

01 - 基于29个预后相关的PRG的HCC亚型聚类分析

        分析了TCGA-CIHC队列中的DEPRGs，结果表明，与训练集中的正常标本相比，90个PRGs在肿瘤组织中上调或下调。更具体地说，15个PRGs在正常标本中上调，而其余75个PRGs在HCC组织中相对提高（图2A）。进行了高置信度（0.7）的PPI分析来描述这些DEPRGs的功能关联网络（图2B）。此外，还计算了相关DEPRGs之间的相关系数，如图2C所示，除了PLG、ORM1、SPP2、HRAS、PPIA和ALB之间存在负相关外，大多数PRGs都具有正的调节关系。随后，为了更好地识别这些DEPRG的潜在生物学功能，作者进行了GO富集分析，结果表明，PRG明显富集的GO术语分别是BP中的 "血小板脱颗粒和激活"、CC中的 "血小板α颗粒 "以及MF中的 "生长因子活性"，这意味着这些差异性基因与血小板密切相关（图2D）。

图2 血小板相关基因（PRG）的表达和功能注释

        基于90个DEPRGs，进一步进行单因素回归分析，以获得与预后相关的PRGs。如图3A所示，发现了29个具有预后价值的PRGs，除了SPP2和GNA14，其余的PRGs被认为是训练集中HCC患者的风险因素。他们的相关网络也显示在图3B。此外，预后基因表达对HCC患者OS的影响也通过KM生存曲线更直观地显示出来（图3C）。

图3 与预后相关的PRG

        基于29个预后相关的PRG，作者进一步利用无监督聚类分析来识别不同的HCC亚型。在TCGA-CIHC队列中确定了两个不同的集群（C1集群：239例，C2集群：131例）（图4A）。OS和PFS显示，两种HCC亚型之间存在明显的生存差异，与C1群相比，C2群患者的预后较差（图4B）。此后，分析了HCC集群与临床病理参数之间的内在联系，图4C显示，集群C2的病例与大多数PRG的高表达和较差的临床特征密切相关，包括T期、肿瘤期和病理分级，这也证实了该HCC亚型的预后不佳。为了进一步探索不同集群之间功能通路和免疫特征的差异，在R软件中进行了GSVA和ssGSEA分析。如图4D所示，与C1群相比，C2亚型主要富集于KEGG途径，如细胞周期、同源重组、DNA复制、癌症相关（如膀胱癌、胰腺癌和肾细胞癌）途径和信号转导轴，包括NOD样受体和mTOR信号途径，意味着C2群可能与HCC的发生和演变有密切关系。此外，采用GO和KEGG分析，对两种不同亚型之间确定的DEGs进行功能注释，并分别显示两者的前10个富集term（图4E-F）。

        此外，根据ssGSEA算法计算的免疫浸润分数，观察到几个免疫细胞（包括aDCs、iDCs、pDCs、巨噬细胞、Th1和Th2细胞以及Tregs）在C2群中有较高的浸润水平，而肥大细胞在C1亚型中有较高的浸润分数（图4G）。同样，大多数免疫功能，如APC共抑制和共刺激、CCR、检查点、HLA、MHC I类、副炎症，以及T细胞共抑制和共刺激，在集群C2中显示出较高的得分，而I/II型IFN反应主要富集在集群C1（图4H）。众所周知，肿瘤免疫微环境与肿瘤的发展和免疫治疗反应密切相关，因此，两种不同的HCC亚型之间浸润免疫细胞和免疫功能的差异可能是决定免疫治疗效果和HCC患者预后的关键因素。

图4 TCGA-CIHC队列中预后性PRG的聚类分析

02 - 血小板相关风险特征

        首先应用之前获得的29个候选预后相关的PRGs，通过LASSO COX回归分析建立风险模型（图1）。然后，根据各自的基因表达和回归系数，构建了一个包含12个PRGs的风险特征，公式如下：风险分数=（0.029 * PRKCD）+（0.066 * HRAS）+（- 0.021 * SPP2）+（0.050 * TUBA4A）+（- 0.370 * GNA14）+（0.035 * EGF）+（0.066 * GNG4）+（0.109 * CFL1）+（0.028 * PPIA）+（0.231 * GNA12）+（0.150 * OLA1）+（0.080 * ANXA5）。训练集中的HCC患者随后根据风险得分的中位数被分为两个不同的风险组（185例高风险和185例低风险），KM生存曲线表明，与低风险患者相比，高风险患者的OS较差（图5A）。此外，类似的结果在外部数据集中得到了进一步的证实，在GSE14520和ICGC-LIRI队列中，高危患者的OS明显低于低危患者（图5B-C）。而图5D-F中也描述了各自队列中不同风险组之间风险评分分布、生存状态和风险基因表达模式的差异。此外，t-SNE以及PCA分析也表明，预后模型在训练和外部验证队列中都能有效地将患者区分为不同的风险组（图5G-I）。

图5 血小板相关风险模型的建立和验证

        为了估计风险特征在预后预测中的效率，作者分别计算了1年、2年和3年ROC曲线中的AUCs。结果显示，TCGA-LIHC队列的年标准化AUC为0.772、0.731和0.717，GSE14520队列为0.705、0.672和0.664，ICGC-LIRI队列为0.720、0.708和0.706（图6A），这意味着风险特征在预后评估中有良好的准确性和稳定性。同时，还将风险特征与其他已发表的预测模型进行了比较，用一致性指数（C-index）来评估不同风险特征的预测能力，用限制性平均生存时间（RMS）来比较不同风险模型区分的组间生存差异。据观察，本研究风险特征与其他特征相比，具有更高的C-指数和更值得注意的生存差异，表明预测模型在横向比较中也有一些优势（图6B-C）。此外，还分别显示了这些对比性风险特征的1年、3年和5年ROC曲线以及生存曲线（图6D-E）。

图6 预测特征的预测效率的交叉验证

        随后，为了探讨签名在具有不同临床特征的患者中的预后价值，作者进一步分析了风险组和临床特征之间是否存在明显的联系。结果表明，高风险评分与肿瘤分期（II-III期）、T期（T2-3）和病理分级（G3）的恶化密切相关（图7A）。同时，风险分数和HCC集群之间也有明显的联系，临床结果差的C2集群与高风险分数明显相关（图7B），图7C中用Sankey图描述了集群、风险组和患者状态之间的线性关系。此外，这些风险基因在训练组和其他两个外部队列中的相关性显示在图7D。随后，进行了单协分析和多协分析来评估风险评分的独立预后效果，训练组的单协分析显示，风险评分和其他几个变量（肿瘤分期，T/M期）都是预后不良的危险因素，多协分析进一步证明了风险评分作为独立危险因素的能力。同时，在GSE14520队列中，BCLC阶段以及风险评分都通过多因素分析被证明是独立危险因素，类似的结果也在ICGC-LIRI队列中发现，风险评分，肿瘤分期，和病理等级被证实是独立的危险因素，而性别被认为是患者OS的保护因素（图7E）。总之，这些发现表明，模型所包含的12个基因的风险特征与临床特征密切相关，也具有良好的预测能力，有望作为HCC患者的潜在预后指标。

图7 风险特征的临床意义

        考虑到TCGA-LIHC队列中不同风险组之间在生物过程和功能通路方面的潜在差异，作者同时进行了GSVA和GSEA分析，以进行个体化调查。GSVA（GO部分）结果表明，高风险患者中明显富集的GO术语是BP中的 "蛋白质定位和折叠的调节"、"细胞周期G2-M期转换的调节"和"有丝分裂过程"。在MF中的"DNA聚合酶结合 "和"泛素样蛋白结合酶活性"，以及在CC中的"无丝分裂促进复合物"，这意味着高风险评分与细胞周期和有丝分裂过程密切相关，这可能与肿瘤发生和发展的调解有关。而在低风险患者中富集的主要GO术语包括BP中的"代谢相关过程"、"凝血和纤维蛋白溶解过程"，MF中的"酶活性"和CC中的"血小板致密颗粒腔"，表明低风险评分与血小板和代谢相关过程紧密相连。此外，几个值得注意的KEGG途径，如 "细胞周期"、"DNA复制"、"RNA降解"以及"泛素介导的蛋白分解"都明显集中在高风险组，相比之下，多个代谢相关的过程，如 "氮代谢"、"氨基酸和脂类相关代谢"以及"药物代谢细胞色素P450 "主要集中在低风险组（图8A）。随后，用GSEA分析来验证上面得到的生物注释。结果发现，高危患者集中的主要KEGG途径是 "细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"ECM受体相互作用"和"神经活性配体-受体相互作用"，而"补体和凝血级联"、"药物代谢细胞色素P450 "以及 "脂肪酸代谢"主要集中于低危患者（图8B）。GO分析表明，与高风险分数相关的顶级术语是"体液免疫反应"、"吞噬作用"和"免疫球蛋白复合物"，而"α氨基酸分解过程"、"药物代谢过程"和"环氧化酶P450途径"是与低风险分数相关的主要术语（图8C）。此外，在两个风险组之间筛选出328个DEGs，并根据这些DEGs采用GO和KEGG分析，结果显示在图8D。

图8 TCGA-LIHC队列中不同风险组之间的功能富集分析

03 - 免疫学特征的调查

        根据多种免疫算法描绘的免疫学景观，发现不同风险组之间的浸润性免疫细胞存在明显的差异，免疫细胞的浸润水平与风险评分呈正相关（图9A）。而基于ssGSEA方法的免疫分析进一步证实，大多数免疫细胞（包括aDCs、iDCs、巨噬细胞、Tfh和Th2细胞以及Tregs）在高风险患者中被计算出较高的浸润分数，反之，其他免疫细胞如肥大细胞和NK细胞在低风险患者中显示出较高的浸润水平。关于免疫功能，如 "APC共刺激"、"CCR "以及 "MHC I类 "与高风险分数相关，而 "细胞溶解活性 "和 "I/II型IFN反应"等功能则与低风险分数相关（图9B）。这些发现与之前聚类分析中得到的结果基本一致，这意味着在两个亚组分析中获得的这些观察结果在一定程度上是令人信服的。此外，分别计算了风险PRG和免疫细胞之间的相关系数，并在图9C中描述。此外，免疫检查点基因以及与抗原表达和免疫反应有关的HLA基因的表达水平差异也显示在图9D中。几乎所有这些基因在高危组中都显示出较高的表达水平，这表明以个人风险分数区分的两个不同群体的免疫状态可能存在潜在差异。

图9 按血小板相关预后特征分类的TCGA-LIHC队列中患者的免疫状况

04 - 基因突变和药敏分析

        考虑到体细胞突变在肿瘤进展和个体临床治疗中的潜在价值，作者分别分析和描述了TCGA-CIHC队列中整个和不同风险组的患者的体细胞突变情况。瀑布图分别显示了整个队列中患者的体细胞突变特征（图10A），以及两个不同风险组中的患者（图10B）。简而言之，与低风险患者相比，高风险患者的突变频率更高，而错义突变是两个风险组中最常见的突变模式。具体来说，TP53的错义突变在高危患者中明显频繁，而AXIN1的框移插入在低危患者中则相对常见。

        作者还探讨了风险评分和TIDE评分之间的关系，以研究风险模型在免疫治疗预测中的潜在意义。结果表明，两个变量之间存在明显的负相关，低风险患者的TIDE评分较高，这意味着我们的风险特征具备免疫治疗预测的能力，与高风险患者相比，低风险患者可能更容易受到免疫治疗的影响（图10C）。

        随后，分析了风险评分与常用化疗药物的IC50值之间的相关性，以探索可行的敏感药物。如图10D所示。10D显示，在高风险组中观察到吉西他滨、多柔比星、硼替佐米、博莱霉素、比卡鲁胺、贝沙罗汀、丝裂霉素C和obatoclax mesylate的IC50值较低。这意味着高风险患者可能从这些化疗药物中获益，而低风险患者可能从以下药物中获益，包括厄洛替尼、多西他赛、二甲双胍、环丙胺、博舒替尼、阿西替尼、尼罗替尼和吉非替尼。

图10 对不同风险状态的患者进行肿瘤突变和药物敏感性分析

05 - 体外功能验证

        为了进一步研究肿瘤细胞和血小板在体外的相互作用，首先从人类外周血中提取和分离血小板，然后与HCC细胞（HepG2和MHCC97H）共培养48小时。图11A显示，RT-qPCR的结果表明，PRKCD、HRAS、TUBA4A、EGF、GNG4、CFL1、PPIA、GNA12、OLA1和ANXA5的mRNA表达水平在血小板刺激后明显升高，而SPP2和GNA14的表达则呈现明显下降趋势，这与预后特征中这些风险基因的表达模式正好一致。同时，N-cadherin（N-ca）、Vimentin（Vim）和Snail的表达也明显增加，而E-cadherin（E-ca）的表达在HepG2和MHCC97H细胞中都显示出相反的趋势，这意味着血小板刺激可以诱导HCC细胞的上皮-间质转化（EMT）（图11B）。

图11

        随后，考虑到研究支持PRKCD和血小板之间的密切关系，作者选择PRKCD作为目标分子进行进一步探索。如图12A-B所示，首先通过si-PRKCD转染敲除PRKCD的mRNA和蛋白表达水平，转染24小时后，加入血小板并与肿瘤细胞共培养48小时。随后，我们研究了不同的转染处理（包括si-NC（对照）、si-PRKCD-1、si-PRKCD-2、si-PRKCD-1 + PLT、si-PRKCD-2 + PLT）对HCC细胞活力和运动能力的影响。CCK-8试验和菌落形成试验都表明，两个HCC细胞的增殖活力受到PRKCD沉默的明显抑制，同样，这种抑制性影响可以通过血小板刺激得到纠正（图12C-D）。此外，转孔实验表明，PRKCD沉默对HepG2以及MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力有明显的抑制作用，这可以通过与血小板直接共培养而得到逆转（图12E）。而伤口愈合试验进一步证明，PRKCD的减少可以明显减弱HepG2和MHCC97H细胞的迁移能力，这种抑制性影响显然被补充血小板所逆转（图12F）。这些发现表明，血小板刺激可以上调PRKCD的表达，通过体外实验进一步证实PRKCD参与介导肿瘤恶性表型，暗示PRKCD参与血小板诱导的HCC进展。

图12 PRKCD对HCC细胞增殖、侵袭和迁移的体外验证

        虽然作为一个正反馈回路，PRKCD是否能影响血小板的激活仍然不清楚。在此，假设HCC细胞中PRKCD的表达水平可以影响体外血小板的激活。为了证实假设，首先通过si-PRKCD转染抑制细胞PRKCD的表达水平（本节选择抑制性能较好的si-PRKCD-1），然后利用PRKCD沉默的HCC细胞直接接触刺激分离的血小板，最终用流式细胞仪分析血小板的激活水平。结果表明，与阴性对照组相比，PRKCD沉默的HCC细胞可以有效地抑制血小板的激活水平（图13）。综上所述，这些结果初步证明了我们的风险基因PRKCD既可以参与调控癌细胞的恶性生物学行为，也可以在体外调控血小板的激活，这意味着PRKCD可能在HCC细胞和血小板的交叉对话中充当了关键的分子桥梁，也在血小板诱导的HCC进展中发挥了重要作用。

图13 流式细胞仪检测与癌细胞共培养后的血小板

四、结论

        这项工作为HCC患者的预后评估揭示了一个新的血小板相关风险特征，并证实了PRKCD是HCC细胞和血小板之间相互作用的关键信使，在介导血小板诱导的肿瘤进展中起着关键作用。这篇论文可能会加强人们对血小板在HCC肿瘤微环境中的认知，并为进一步探索有价值的、潜在的HCC治疗策略开辟了新的视野。