细胞核丝状肌动蛋白组织在卵巢癌中的潜在机制的研究
近日，复旦大学青年研究员郑义艳团队在期刊Frontiers in Cell and Developmental Biology（IF：6.081）上发表了题为Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning的研究论文，在卵巢癌中报道了丝状肌动蛋白的潜在机制。
研究内容
丝状肌动蛋白（F-actin/F-肌动蛋白）和球状肌动蛋白存在于体细胞的细胞核中，并参与了染色质重塑、基因转录调控和DNA损伤修复。然而，细胞核F-肌动蛋白在细胞中聚合的潜在机制仍未得到完全理解。此研究使用小分子抑制剂库筛选并结合了深度学习的方法，确定了参与卵巢癌细胞核F-肌动蛋白聚合的潜在激酶靶点。研究中使用的抑制剂的靶点分析表明，PI3K-AKT通路参与调控卵巢癌细胞中细胞核F-肌动蛋白组织。此研究为揭示核F-肌动蛋白在卵巢癌中的重要作用以及理解核F-肌动蛋白结构是如何组织的奠定了基础。
文章详情
文章题目：Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning
中文题目：通过高通量筛选结合深度学习来研究细胞核丝状肌动蛋白组织在卵巢癌中的潜在机制
发表时间：2022.05
期刊名称：Frontiers in Cell and Developmental Biology
影响因子：6.081
DOI：10.3389/fcell.2022.869531
研究思路
卵巢癌细胞中核F-肌动蛋白结构的特征分析
研究者以卵巢癌为模型，研究细胞核F-肌动蛋白是否存在于癌细胞中。研究者制备了多种稳定表达nAc-citrine的卵巢癌细胞系。nAc(核肌动蛋白染色体)是核肌动蛋白结合探针，其可与荧光标签citrine熔合。利用该探针，研究者在不同卵巢癌细胞系中检测了细胞核中的F-肌动蛋白，不同细胞系表达核F-肌动蛋白的细胞比例不同(图1A-C)。尤其在OVCA432-nAc-citrine细胞中核F-肌动蛋白的占比可达到约70%(图1C)。在其他细胞系中，如HEY-nAc-citrine中核F-肌动蛋白的占比很少(图1C)。研究者进一步分析了卵巢癌细胞株OVCA432中核肌动蛋白丝的数量、厚度和长度(补充图S1A-C)。随后他们进行了z-slice分析，结果证实了nAc-citrine细胞核内结合了F-肌动蛋白 (图1D)。此外，层蛋白A/C染色显示F-肌动蛋白结构没有延伸出核膜(图1E)。这些分析表明，F-肌动蛋白组装发生在卵巢癌细胞系的细胞核中。并且在没有nAc-citrine表达的SKOV3细胞系中，通过phalloidin染色证实了核F-肌动蛋白的存在(图1F)，表明获得的核F-肌动蛋白信号不是nAc-citrine标记和/或异位表达的伪信号。为了研究nAc-citrine的过表达是否有助于调控卵巢癌细胞系的基因表达，研究者对OVCA432-nAc-citrine和OVCA432细胞进行了Bulk RNA测序来比较他们的转录谱。饱和度分析显示，OVCA432- nAc -citrine细胞和OVCA432细胞具有相似的曲线(补充图S1D)，说明这两种细胞的总RNA质量相似。同时，OVCA432-nAc-citrine与OVCA432之间的差异表达基因非常少(补充图S1E)，说明过表达nAc-citrine不可能在整体水平上重塑基因表达。这表明，在卵巢癌细胞系中使用nAc-citrine探针标记核F-肌动蛋白是可行的。
为了进一步研究三维培养物中的核F-肌动蛋白组织，研究者生产了SKOV3细胞的球状体，其稳定地表达lifeact（F-肌动蛋白结合探针），并与荧光标签citrine融合。在3D培养中，他们检测到明显的核F-肌动蛋白结构(图1G,H)。为了进一步表征核F-肌动蛋白组织的新生特征，他们又对SKOV3-nAc-citrine细胞进行了活细胞成像，并记录了核中F-肌动蛋白的动态变化，结果显示核F-肌动蛋白结构的形成不是暂时的(补充 Videos S1-S3，此处未列出)。
对卵巢癌细胞系中核F-肌动蛋白组织的分析促使研究者在卵巢癌患者的肿瘤细胞中检查这些结构的存在。在细胞核F-肌动蛋白染色前，PAX8免疫荧光证实了新鲜冷冻肿瘤切片中存在卵巢癌细胞(补充图S2A)。具有代表性的图像显示，高级别浆液性卵巢癌患者的肿瘤细胞中存在核F-肌动蛋白(图1I,J)。研究者使用z-slice分析进一步证实这些F-肌动蛋白结构存在于细胞核内(图1K,L)。随后研究者使用Imaris通过一系列phalloidin染色连续图像重建了细胞核内F-肌动蛋白结构的3D模型，其中具有代表性的图像如图1I,J所示。再次证实了细胞核内明显可见F-肌动蛋白组织(图1M and 补充Video S4，Video此处未列出)。此外，他们使用同一卵巢癌患者的另一个肿瘤切片在癌细胞中发现了这些核F-肌动蛋白结构(补充图S2B-E)。
图1 卵巢癌细胞中核F-肌动蛋白结构的特征
补充图1
补充图2
卵巢癌细胞中调节核F-肌动蛋白组装的激酶的鉴定
为了解剖卵巢癌细胞中核F-肌动蛋白聚合的机制，研究者重点关注激酶靶点。他们利用商业小分子抑制剂库TargetMol和高通量筛选系统(High-Content Screening system, HCS)在卵巢癌细胞中寻找参与核F-肌动蛋白组织的潜在激酶靶点。由于OVCA432-nAc-citrine细胞系在细胞核中具有显著的F-肌动蛋白结构，他们使用来自TargetMol文库的单个小激酶抑制剂处理这些细胞，该文库包含1247个小分子抑制剂。筛选流程如图2A所示。研究者选择BMS3（其可靶向LIMK激酶）作为阳性对照进行高通量筛选。总共产生了大约38000张图像的数据集。代表性图像如图2B所示，表明BMS3和UM164的小分子能够抑制OVCA432-nAc-citrine细胞中核F-肌动蛋白聚合。
接下来，研究者开发了一个深度学习渠道，使用人工智能框架分析带有核F-肌动蛋白的OVCA432 - nAc - citrine细胞(图2C)。此研究使用的深度学习模型基于YOLOv5, YOLOv5是YOLO系列的最新版本。在该模型中，利用框架的焦点层来降低模型的权重。在使用标注的细胞进行训练和验证的环节中(图2C)，对总细胞检测的准确率为0.958，召回率为0.891，对核F-肌动蛋白细胞检测的准确率为0.917，召回率为0.904。重要的是，将未标注的细胞随机分配给人工计数总细胞或核F-肌动蛋白细胞，结果与深度学习模型一致。因此，该模型是一个可行的工具，以支持进一步的图像分析在高通量水平。该模型的应用使研究者能够识别调控卵巢癌细胞中核F-肌动蛋白组织的小分子抑制剂(图3A)。研究者汇集了小分子抑制剂，使细胞核F-肌动蛋白含量降低20%以上的细胞，或使细胞核F-肌动蛋白含量提高15%以上的细胞。这些抑制剂的激酶靶点见补充图S3A,B。然后，他们使用这些激酶靶点进行KEGG通路富集分析。这表明PI3K-AKT可能参与卵巢癌细胞中核F-肌动蛋白组织(图3B)。为了进一步证实这一点，研究者选择了所有具有深度学习算法特征的激酶，因为它们可以重塑核F-肌动蛋白结构。36种抑制剂被证明与PI3K-AKT通路相关，其中23种抑制剂具有抑制核F-肌动蛋白聚合的作用，而其他13种抑制剂则具有促进核F-肌动蛋白聚合的作用。随后，他们使用这36种抑制剂处理OVCA432-nAc-citrine细胞，同时DMSO作为阴性对照，BMS3作为阳性对照。结果显示：下调组的21种抑制剂和上调组的4种抑制剂对核F-肌动蛋白组织的调节作用一致(图3C,D)。因此，研究者确信PI3K-AKT通路在核F-肌动蛋白形成中发挥重要作用。
图2 利用小分子抑制剂库进行高通量筛选
图3 卵巢癌细胞中参与核F-肌动蛋白组装的激酶的鉴定
主要结论
此研究揭示了F-肌动蛋白存在于卵巢癌细胞系的细胞核中，更重要的是，此研究在新鲜冷冻肿瘤切片中揭示了核F-肌动蛋白的组织。卵巢癌的一线治疗是细胞修复手术结合化疗药物，包括铂类药物。由于铂类药物通过连接DNA碱基诱导卵巢癌细胞的DNA损伤，因此检测核F-actin是否参与卵巢癌细胞的DNA损伤修复，以及这些结构在卵巢癌的背景下是否具有临床意义将是十分重要的。
参考文献
Wu W, Xing X, Wang M, Feng Y, Wietek N, Chong K, El-Sahhar S, Ahmed AA, Zang R, Zheng Y. Investigation of the Potential Mechanisms Underlying Nuclear F-Actin Organization in Ovarian Cancer Cells by High-Throughput Screening in Combination With Deep Learning. Front Cell Dev Biol. 2022 May 26;10:869531. doi: 10.3389/fcell.2022.869531. PMID: 35693931; PMCID: PMC9178185.
