文献(2): 综述_癌症相关成纤维细胞(CAF)的异质性【建议收
上一个单细胞课题做了一些关于CAF的工作，当时就参考了这一篇综述。细胞亚群的解读算是单细胞课题中耗时耗力的内容，非免疫细胞更是如此，因为非免疫细胞的文献比免疫细胞少多了。这一篇综述系统总结了2020年之前单细胞领域CAF的一些工作，值得仔细读读。我个人觉得CAF是TME里面比较有趣的一块内容，欢迎大家在公众号后台留言交流呀~
如果需要文献原文和翻译，可在后台直接回复20210309
摘要
尽管近几十年来癌症治疗取得了显著进展，但晚期癌症的预后仍然很差。传统的以肿瘤细胞为中心的观点只能解释部分癌症进展，因此对肿瘤微环境(TME)的深入理解至关重要。在TME内的细胞中，与癌症相关的成纤维细胞(CAF)作为癌症治疗的靶标引起了人们的关注。 但是，CAF呈现出异质性，为了开发出针对CAF的新型疗法，需要对CAF进行更详细的分类，并且需要研究每个亚群的功能。在这种大环境下，将新开发的方法应用于单细胞分析已经加深了我们对CAF异质性的理解。在这里，我们回顾了有关CAF异质性和功能的最新文献，并讨论了针对CAF亚群的新型疗法的可能性。
1. 引言
自从发现致癌基因以来，我们对癌症分子基础的理解已取得了实质性进展。迄今为止，已经发现了许多癌基因和抑癌基因，并且在过去的几十年中，这种知识为分子靶向疗法的发展做出了贡献。尽管癌症治疗有了显着改善，但对于许多癌症而言，晚期癌症的预后仍然很差。因此，迫切需要开发新的有效的癌症疗法。传统的以肿瘤细胞为中心的观点只能部分解释癌症进展。周围的肿瘤微环境(TME)在恶性进展过程中通过旁分泌，邻分泌和自分泌通讯(paracrine, juxtacrine, and autocrine)共同进化为活化状态，从而创建了动态信号回路，有助于癌症的发生，发展和对治疗的抵抗。TME的重要性已被多项研究证实，这些研究证明了乳腺癌，肺癌和大肠癌患者中微环境的细胞类型的基因表达模式与预后之间的关联。TME作为癌症治疗的靶标和具有预后和/或预测潜力的生物标志物的丰富来源正引起人们的关注。 肿瘤微型器官的基本结构由癌细胞，内皮细胞，周细胞，成纤维细胞，各种白细胞和细胞外基质组成。CAF是一系列不同肿瘤类型中最丰富的细胞类型之一，并且越来越多的证据表明CAF在影响恶性表型方面起着重要作用。
2. CAF的标志和起源
CAF的广义定义是位于肿瘤块内或附近的成纤维细胞。在实际操作中，CAF被定义为纺锤形细胞，不表达上皮，内皮和白细胞的marker基因。需要注意的是，在这种实际情况下，通过EMT转分化为成纤维细胞样或杂合状态的癌细胞可以包含在CAF中。已经从一系列恶性组织中分离出CAF，所述恶性组织包括前列腺癌，肺癌，乳腺癌，胃癌，结直肠癌和胰腺癌。相比之下，CAF在脑癌，卵巢癌和肾癌的样本中相对较少。表1总结了一些报告的CAF标记。波形蛋白(Vimentin, VIM)被认为是静息CAF的标记，而α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA, ACTA2)，成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP-1, S100A4），成纤维细胞活化蛋白(FAP)，肌腱蛋白C(细胞粘合素C、Tenascin-C, TNC)，骨膜素(Periostin, POSTN)，结蛋白(Desmin, DES) ，血小板衍生生长因子受体α(PDGFR-α, PDGFRA)，PDGFR-β(PDGFRB)，Thy-1(THY1)，平足蛋白(Podoplanin, PDPN)，整联蛋白β1(Integrin β1, ITGB1)，微囊蛋白-1(Caveolin-1, CAV1)被认为是活化的CAF标记。每个标记定义了不同细胞亚群，它们部分重叠但显示不同表达谱。换句话说，没有单个标记可以定义完整的CAF，也不能将CAF与所有其他细胞类型区分开。例如，肌成纤维细胞被认为是活化成纤维细胞的子集，其特征在于从头表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），其具有收缩和分泌特性，有助于伤口愈合和癌症发展过程中的组织修复。可以想象，CAF的异质性可能来自处于不同分化阶段的细胞，它们来自共同的前体，依赖于内部和外部信号提示而采用不同状态的细胞，或者来自具有不同起源的细胞。据报道，正常的成纤维细胞可以通过与癌细胞的通信获得CAF表型。也有报道说，可以对CAF进行重新编程以减少CAF表型，表明这种转变是可逆的。基于此，CAF表型的至少一部分被认为是成纤维细胞的细胞状态，而不是固定的细胞类型。实际上，CAF的来源可能多种多样，包括：(a)组织驻留的成纤维细胞, (b)从其他细胞类型（如内皮细胞，上皮细胞，血管平滑肌细胞，周细胞，脂肪细胞及其祖细胞）转分化的细胞, (c)通过EMT转分化为间充质细胞的肿瘤细胞和(d)骨髓来源的前体细胞和骨髓间充质干细胞(BM-MSC)。
TABLE 1 Markers for cancer associated fibroblasts
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3. 研究CAF的方法学的发展
使用来自多个癌症患者CAF的细胞培养进行的几项研究表明了CAF的异质性。 Herrera等人从15例原发性人类结肠癌中建立了原代CAF培养物，并阐明了每种CAF培养物/在成纤维细胞来源的旁分泌效应/促癌细胞转移中/的差异。而且最能够促进转移的CAF的基因表达特征对结肠癌患者的临床结局显示出预后价值。 Hao等对28个非小细胞肺癌的2个CAF亚群进行了特征分析。他们将CAF与成纤维细胞的高或低增殖进行了比较，并证明促结缔组织增生的CAF胶原基质重塑，侵袭和肿瘤生长速率增加。这些研究证明了来自不同患者的CAF的不同表型，因此说明了CAF类群在患者之间的高度差异。但是，这些研究并未直接解决同一肿瘤内CAF的异质性。
尽管基于免疫组织化学研究已知CAF呈现出异质细胞群，但是研究CAF的基因表达或功能的实验方法长期以来一直局限于bulk分析，直到单细胞技术出现才有所改观。由于常规的bulk分析只能提供整个细胞群体中基因表达的平均值，并且主要反映的是主要细胞亚群的表型，因此来自次要细胞亚群的信息只能在较低程度上被反映。
4. 癌症相关成纤维细胞的瘤内异质性研究
迄今为止，一些详细探讨CAF异质性的研究已发表。一些CAF的分类研究见表2。
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4.1 乳腺癌
我们最近使用来自乳腺癌的MMTV-PyMT GEMM的间充质细胞的单细胞转录组定义了CAF在空间和功能上不同的亚群（图2A-C）。19只MMTV-PyMT小鼠使用小鼠乳腺肿瘤病毒（MMTV-LTR）的长末端重复序列作为启动子来驱动乳腺特异性多瘤病毒中T抗原的表达，从而发展出与人乳腺癌相似的自发乳腺肿瘤。使用FACS挑选了从MMTV-PyMT小鼠肿瘤中分离的768个间充质细胞，并进行了scRNA-seq分析，发现了4个不同的CAF亚群。根据独特基因集的功能注释，我们用血管CAF（vascular CAF, vCAF），基质CAF（matrix CAF, mCAF），周期CAF（cycling CAF, cCAF）和发育CAF（developmental CAF, dCAF）命名。值得注意的是，Pdgfra由mCAF中的细胞特异性表达（译者注：原文图中显示的是不表达），而Pdgfrb由除dCAF以外的所有细胞表达。发现vCAF的基因表达谱显着富集了与血管发育和血管生成功能相关的基因。与肿瘤的边缘相比，vCAF的marker基因Des（desmin）的表达在肿瘤核心明显更高。mCAF富含与细胞外基质和EMT相关的转录本。mCAF的marker基因Fbln1和Pdgfra在肿瘤的浸润性前端显示更多的阳性细胞，而在肿瘤核心中mCAF的丰度相对较低。 cCAF包含处于细胞周期G2，M或S期的细胞，经仔细检查后发现它们代表vCAF亚群的增殖子集。最后，dCAF通过与各种干细胞（Scrg1，Sox9和Sox10等）相关的基因表达来区分。在dCAF中，检测到PyMT癌基因的表达，表明该细胞亚群的恶性细胞起源。相反，纵向研究表明，vCAF和mCAF分别来自血管周围和源自成纤维细胞。综上所述，我们的研究描述了乳腺癌CAF亚群来自不同起源，从而证实了长期存在的观点：CAF异质性一定程度上源自不同来源的细胞的募集。有趣的是，基于我们的数据集，可以用marker基因来区分不同来源的CAF。例如，可以注意到Thy1将非恶性（vCAF / mCAF）起源的CAF与恶性（dCAF）起源的CAF区分开（图2D）。
Friedman等分析了鼠三阴乳腺癌模型4T1中CAF的亚型，并报告了CAF亚型的组成随癌症进展而改变。他们分析了使用负向FACS选择策略分离的8987个间充质细胞转录组的scRNA-seq。分析揭示了以Pdpn表达(pCAF)和S100a4表达(sCAF)为特征的2组CAF。正常的乳腺成纤维细胞表达Pdpn，但缺乏S100a4。更彻底的分析表明，pCAF包括6个亚型（早期免疫调节，晚期免疫调节，伤口愈合，胞外纤维组织，炎性A和炎性B），而sCAF包括2个亚型（蛋白质折叠和抗原呈递）。有趣的是，sCAF富集了几种经典的BM-MSC(bone marrow mesenchymal stem cells)标记，包括Clu，这暗示着BM-MSC的起源。值得注意的是，发现sCAF亚群的比例是动态的，并且随着肿瘤的进展，表达MHC II类的抗原呈递亚群占据主导地位。在这篇评论文章中，我们用我们的研究确定了CAF亚型，并覆盖了Friedman等人研究中3个关键基因Pdpn，S100a4和Clu的表达（图2D）。虽然Pdpn主要由mCAF表达，而Clu是dCAF的特有标记，但S100a4由我们研究中的每个CAF亚群中的一部分细胞表达。尽管注意到了相似性，但存在的差异可能说明了不同的小鼠模型（GEMM与细胞系）之间的异质性，或者是由于细胞挑选策略的不同。
Costa等人使用FACS对人类乳腺癌的CAF进行了详细的表征。他们采用了6种标记：FAP，Integrin β1，α-SMA，FSP-1，PDGFR-β和Caveolin-1将CAF分为4个不同的亚群：CAF-S1，CAF-S2，CAF-S3，CAF-S4。作者进一步证明了CAF-S1亚群与免疫抑制微环境有关。作者发现几种CAF亚型在乳腺癌分子亚型中差异积累，在luminal A肿瘤中CAF-S2富集以及在basal-like乳腺癌中观察到CAF-S1和CAF-S4的积累。同研究组的Pelon等证明，CAF-S1和CAF-S4在转移性淋巴结中积累。有趣的是，他们还证明了在诊断时淋巴结中具有高水平CAF（尤其是CAF-S4）的患者易于发生远端转移。我们还在数据集中生成了Costa等人使用的6个基因的小提琴图（图2D）。尽管我们无法与其子类型进行直接比较，但仅基于这6个标记，似乎我们分类中的亚型与它们的任何一个亚型都不相同。
Su等人报道了CAF的一个重要功能子集，其由乳腺癌和肺癌中的细胞表面分子CD10和GPR77定义。这项研究表明，CD10 + GPR77 + CAF通过为癌症干细胞提供生存niche来促进肿瘤形成和化学抗药性。有趣的是，CD10和GPR77均由我们研究揭示的dCAF亚群中的细胞显着表达（图2D）。如上所述，表明dCAF源自经历了EMT的肿瘤细胞。基于这些发现，CD10 + GPR77 + CAF实际上可能源自恶性细胞本身。
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4.2 胰腺癌
根据Tuveson小组提出的分类，胰腺癌中CAF的异质性是可以理解的。首先，Öhlund等使用GEMM报告了2种空间分离，可逆和互斥的CAF亚型。这些被称为肌成纤维细胞CAF（myCAF）和炎性CAF（iCAF）。myCAF由FAP阳性α-SMA高表达定义，具有TGF-β反应基因谱，并位于肿瘤细胞附近。相比之下，iCAF由α-SMA低表达，IL-6高表达定义，并且位于促纤维增生区中远离肿瘤细胞的位置。另外，iCAF具有高表达的细胞因子基因，例如Il6，Il11和Lif，以及趋化因子，例如Cxcl1和Cxcl2。随后，Biffi等人报告了建立这些独特成纤维细胞亚型的机制。他们使用类器官和小鼠模型证明IL1诱导白血病抑制因子（LIF）表达和下游JAK / STAT激活以生成iCAF，并且TGF-β通过下调IL1R1表达以促进分化为myCAF来拮抗这一过程。此外，Elyada等报告了表达MHC II类和CD74类的第三种CAF亚型，称为抗原呈递CAF（apCAF）。有趣的是，apCAF以抗原特异性方式激活CD4+ T细胞。
在胰腺癌中采用scRNA-seq的两项研究支持上述分类。 Hosein等使用GEMM对scRNA-seq进行了分析，并支持Öhlund等提出的CAF分类。他们对804个晚期KIC细胞进行了测序，并定义了2个CAF亚型FB1和FB3。 FB1组表达胰岛素样生长因子信号基因（Igfbp7，Igfbp4和Igf1），Pdgfra，Cxcl12，Il6和其他几种细胞因子（Ccl11，Ccl7，Ccl2和Csf1），并被认为对应于iCAF。 FB3亚群的肌成纤维细胞标志Acta2和Tagln呈阳性，并与myCAF亚群相似。值得注意的是，FB3基团还表达了MHC II成分，因此也可以掺入apCAF。 Öhlund等人提出的CAF分类已被Bernard等人使用人类样品进一步验证，他们对来自手术切除的2个低级别导管内乳头状黏液性肿瘤（IPMN），2个高级别的IPMN 和2个PDAC的5403细胞进行了scRNA-seq。有趣的是，myCAF在所有三种组织学类型中均得到了识别，尽管myCAF在低级别IPMN中很少见，而在高级别IPMN中占很高的比例。相反，仅在PDAC中识别了iCAF。与scRNA-seq方法相比，Neuzillet等采用了不同的策略，通过对16种CAF原始培养物中的770基因表达进行NanoString nCounter分析，研究了PDAC中CAF的异质性。这项研究基于转录组分析，确定了4种CAF亚型，称为亚型A-D。另外，通过免疫组织化学证实了在个体患者样品中共存在多种CAF亚型。比较它们的分类，以及由Öhlund等人提出的分类，表达ACTA2和ECM成分的亚型B和D与myCAF相似，而亚型C与iCAF相似，而亚型A具有iCAF和myCAF的特征。有趣的是，该研究还证明了非肿瘤胰腺星状细胞长时间暴露于癌细胞系的条件培养基中会诱发CAF样表型，这由CAF B和C亚型相关基因表达的增加所证明。
最近的报告显示，CAF亚型可能成为增强癌症患者对免疫检查点抑制疗法响应的潜在靶标。 Dominguez等在PDAC中鉴定了由TGF-β编程的CAF亚群，并表达LRRC15蛋白。他们进一步证明，在临床试验中，LRRC15 + CAF信号水平升高与anti–PD-L1治疗的不良反应相关，证明了CAF亚群可作为生物标志物，指导治疗方案的选择。
4.3 肺癌
Lambrechts等分析了5例肺腺癌或肺鳞癌患者手术样本中的52698个细胞的scRNA-seq。鉴定出52个基质细胞亚型。在它们当中，发现了5种不同类型的成纤维细胞，即亚群1、2、4、5和7。亚群1和4相似，亚群1显示出明显的EMT和广泛的细胞外基质蛋白和TGF-β相关基因。亚群4在肿瘤的边缘富集，而亚群2表现出ACTA2的高表达。亚群5和7高度相似，具有较低的肌生成和较高的mTOR基因表达。亚群5和7之间的差异主要与糖酵解基因的表达有关，表明各种CAF亚群之间的代谢差异。此外，亚群5富集在肿瘤核心，而亚群7富集在肿瘤边缘，进一步突出了空间位置的差异，这是CAF异质性的关键组成部分。
4.4 大肠癌
Li等分析了11例大肠癌患者手术样本中的969个细胞的scRNA-seq。 他们确定了CAF的2个不同的亚型，CAF-A和CAF-B。 CAF-A细胞表达与细胞外基质重塑有关的基因，包括TGF-β激活剂MMP2。CAF-B细胞表达肌成纤维细胞的标志物，例如ACTA2，TAGLN和PDGFA。但是，应该指出的是，这种分类是基于很少的细胞，并且没有任何原位的空间映射，因此需要在进一步的研究中得到证实。
4.5 头颈部鳞状细胞癌
Puram等报告了对18例头颈部鳞状细胞癌患者的手术样本中约6000个细胞的scRNA-seq的分析。 肿瘤内的成纤维细胞分为4组：myofibroblasts(肌成纤维细胞)，CAF（CAF1和CAF2）和resting Fibroblasts(静息成纤维细胞)。 肌成纤维细胞亚群表达ACTA2和肌球蛋白轻链蛋白（MYLK，MYL9）。CAF亚型表达受体，配体和ECM基因，包括FAP和PDPN。 静息成纤维细胞缺乏肌成纤维细胞和CAF标记的表达。进一步的分析将CAF分为2种类型：CAF1和CAF2。 CAF1类型表达COL1A1，间充质标记（例如VIM，THY1）和ECM蛋白（例如MMP11，CAV1），而CAF 2类型表达immediate early response基因（例如JUN，FOS），配体和受体（例如 FGF7，TGFBR）。有趣的是，他们还发现来自淋巴结的成纤维细胞富含肌成纤维细胞和CAF1亚群。
5. 靶向CAF亚群
对CAF亚群功能定义的研究表明，特定CAF亚群可以被用作治疗靶标。尽管迄今为止，尚未得到临床证实，但一些研究报告了CAF亚群靶向治疗的临床前研究。在我们以前的报告中，Pdgfra由mCAF亚群中的细胞特异性表达。根据体外研究，血小板衍生生长因子（PDGF）-CC被认为是PDGFR-α的选择性配体，证明PDGF-CC可以激活PDGFR-α同二聚体以及PDGFR-α/β异二聚体。我们证明了在基底样乳腺肿瘤微环境中癌细胞与PDGFRα+ CAF之间的PDGF-CC旁分泌信号传导控制了乳腺癌分子亚型。癌细胞来源的PDGF-CC激活了mCAF，并诱导它们分泌HGF，IGFBP3和STC1，其作用促成了乳腺癌细胞的雌激素受体（ER）α阴性表型。此外，PDGF-CC的遗传或药理学阻断作用通过诱导luminal表型，促使先前耐药的乳腺肿瘤对激素治疗敏感。这些发现表明，在ERα阴性乳腺癌患者中，可以使用阻断PDGF-CC /PDGFRα轴信号传导的药物作为靶向mCAF治疗的新方法。如Friedman等人的研究所定义， Podoplanin标志着CAF的特定亚群，并引起了人们的关注，成为治疗的目标。已在各种恶性肿瘤中鉴定了表达Podoplanin的CAF，并已报道其是乳腺癌和肺癌的预后因素。也有报道说，CAF表达的Podoplanin在功能上是促进小鼠皮下组织肿瘤形成的原因。迄今为止，已经在临床前模型中开发和测试了靶向Podoplanin的抗体，CAR-T细胞，生物制剂和合成化合物，这些疗法可能构成表达Podoplanin CAF的靶向疗法。在先前描述的Li等人的研究中，CAF-A专门表达FAP。由于FAP在85％-90％的原发性和转移性结直肠癌中被CAF过度表达，并且在正常组织中无法检测到，因此FAP被认为是对癌症治疗毒性最小的合适靶标。多项临床试验已经探索了靶向表达FAP的细胞的方法。但是到目前为止，它们都失败了。免疫检查点抑制已成为患者最有希望的治疗选择之一。如前所述，Dominguez等证明LRRC15 + CAF与anti–PD-L1治疗反应差有关。这表明特定的CAF亚群可能是改善免疫疗法的潜在目标。针对这一特定CAF亚群的新疗法需要进一步的研究。
6. 当前研究的局限性和未来的方向
尽管基于scRNA-seq对CAF进行分类的研究已提供了大量信息，但这些研究仍存在一些局限性。首先，目前尚不清楚每个CAF亚群是否在所有癌症类型中均得到保留。其次，还不清楚基于小鼠模型的CAF分类是否可以应用于人类癌症。在乳腺癌中，使用小鼠模型进行的研究仅提供了一种代表性的乳腺癌组织学类型的信息，而人类乳腺癌则具有多种组织学类型，因此具有更高的复杂性。跨癌症类型和物种的多个scRNA-seq数据集的联合分析将在将来回答这些问题。第三个限制是缺乏有关CAF起源的直接信息。对scRNA-seq的分析仅在特定时间点提供有关转录组的信息，因此无法获得显示特定亚群起源的直接信息。由于缺乏针对正常成纤维细胞的高度特异性Cre驱动程序，因此在小鼠中进行谱系追踪研究仍然很少，然而，基于从scRNA-seq研究收集的信息，可以开发出新颖的工具，并可能有助于揭示CAF的起源。最后，使用RNA或蛋白质的多重可视化技术对CAF亚群进行空间分辨率分析可能会成为一种越来越有价值的工具，用于了解不同肿瘤类型之间CAF之间异质性的全部复杂性。
reference
Kanzaki R, Pietras K. Heterogeneity of cancer‐associated fibroblasts: Opportunities for precision medicine[J]. Cancer Science, 2020, 111(8): 2708.
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