2022-10-11

Nat Biotech | 分离式架构促进更快速地筛选引导编辑变体

原创 图灵基因 图灵基因 2022-10-11 17:19 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

引导编辑使用CRISPR引导的逆转录来实现任何所需碱基替换或小插入或删除的可编程引入。使用引导编辑系统的一个挑战是所需的引导编辑蛋白2（PE2）的体积很大。PE2由nSpCas9（化脓性链球菌Cas9切口酶）和与其C端融合的突变MMLV-RT（小鼠白血病病毒逆转录酶）结构域组成，通常由6351个碱基对编码的2117个氨基酸组成。

马萨诸塞州总医院（MGH）的研究人员创建了一个名为Split 引导编辑（Split-PE）的系统，该系统将nSpCas9和MMLV-RT蛋白分离，以在人体细胞中与完整的PE2一样有效地发挥作用。这些结果和试剂对于改进引导编辑具有重要意义，并有助于加速引导编辑在研究和治疗用途中的优化和应用。

研究结果发表在《Nature Biotechnology》杂志上的一篇题为“Engineered CRISPR prime editors with compact, untethered reverse transcriptases”的研究文章中。

在现有的引导编辑系统中，突变是由引导编辑蛋白和引导编辑导向RNA（pegRNA）诱导的。该pegRNA引导nSpCas9活性以产生一个带有切口DNA链的R环，其在pegRNA的3′端退火为引物结合序列（PBS）。引导编辑蛋白的逆转录酶部分随后将与PBS相邻的逆转录模板逆转录到DNA中，编码所需的相关编辑。然后，这个DNA模板通过一种尚未完全定义的机制将编辑引入基因组位点。

来自MGH的第一作者Julian Grünewald、Bret R. Miller和Regan N. Szalay发现，即使在分离时，引导编辑蛋白的逆转录酶和nCas9成分也能有效发挥作用。MGH的研究人员使用这种Split-PE（引导编辑）系统来快速识别和设计更紧凑的引导编辑架构，这也拓宽了用于引导编辑的逆转录酶类型。

结果表明，对于现有的完整的引导编辑蛋白，逆转录酶活性可能是由第二个引导编辑分子提供的，该分子可能不与目标DNA位点结合，可能来自溶液。这反过来意味着，通过创建不同的下一代融合，可以进一步提高引导编辑的效率，在这种融合中，逆转录酶实际上必须以顺式作用于nCas9（即逆转录酶活性依赖于连接到目标位点的配置）。

所述的Split-PE和缩小尺寸的逆转录酶提供的试剂和架构应该能够增强和更好地实现引导编辑组件的交付，并加速平台的进一步改进。Split-PE解决了大小受限的AAV载体所施加的限制——即全长PE2蛋白太大而无法放入单个AAV载体中。通过利用Split-PE结构，可以在一种AAV中编码nSpCas9蛋白，在另一种AAV中编码pegRNA/gRNA和逆转录酶。这创建了一个配置，其中只有被两个载体转导的细胞将进行编辑，而不需要额外的组件。

作者还注意到，我们的Split-PE系统有望增强和简化RNA和核糖核蛋白的递送方法，因为它能更有效地表达更短长度的nCas9和逆转录酶组分，而不是将这两个组分进行全长融合。这种模块化还应该允许快速筛选替代切口Cas9或其他切口酶以进行引导编辑。

这些研究表明，分离式架构可以促进更快速地筛选具有改进特性的新引导编辑变体。MGH 研究人员无需为每个逆转录酶变体克隆和测序一个新的冗长融合，并确定在何处以及如何将每个逆转录酶变体融合到切口Cas9上，而是能够快速构建并筛选出一系列不同的病毒、非病毒和工程逆转录酶，以识别那些具有所需活性的逆转录酶。

这一发现为挖掘存在于各种细菌和古细菌中的大量非病毒、细菌II组内含子逆转录酶（G2I-RT）作为设计引导编辑器的起点提供了可能性，这些引导编辑器不仅更小，而且还可以提供改进的功能，如更高的保真度或更大的处理能力。最近的一次计算搜索产生了4000多个G2I RT，从中可以明显看出，这个可能用于引导编辑器的逆转录酶宝库的巨大规模。