RNA m6A甲基化通过Hippo途径促进肝癌血管生成拟态的形成

前言

肝癌是导致癌症相关死亡的第四大常见原因，在世界范围内发病率排名第六。肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的大多数。虽然近年来HCC的治疗取得了很大进展，但HCC患者的预后仍然很差。血管生成对促进肝细胞癌的生长和转移至关重要。既往研究表明，肿瘤中的血管仅由内皮细胞形成。自上世纪90年代，许多制药公司集中精力开发抑制血管生成的化合物，以“饿死肿瘤细胞”。一些药物，如Avastin和Nexavar，已被美国批准用于癌症治疗。然而，这些药物只是暂时减缓肿瘤的生长，而且不能完全杀死肿瘤细胞。此外，许多用这些药物治疗的肿瘤往往产生耐药性或转移。1999年，Maniotis发现了血管生成拟态（Vasculogenic mimicry, VM）。他认为，肿瘤中有功能的血供通道可能与内皮细胞无关，而是由侵袭性肿瘤细胞形成的。这一发现为肿瘤的血液供应提供了一个新的视角。到目前为止，VM存在于多种癌症类型中，如黑色素瘤、卵巢癌、结直肠癌、喉部鳞状细胞癌、HCC等，并与患者预后不良有关。VM是由侵袭性肿瘤细胞形成的模拟血管生成网络，在肝细胞癌的恶性肿瘤中起重要作用。然而，VM的发病机制是复杂的，并没有完全明确。N6-methyladenosine (m6A) 是真核生物mRNA中最丰富的可逆甲基化修饰。近年来，许多研究集中在m6a修饰的mRNA的生物学功能上。m6A修饰被发现参与多种生物学过程，并在癌症进展中发挥重要作用。然而，m6A与VM形成之间的关系尚不清楚。

研究结果

➀ 临床HCC组织中METTL3的表达与VM及患者预后不良有关

作者利用CD34或CD31和periodic acid–Schiff  (PAS)双重染色来区分基质VM的形态模式特征。首先，对75例HCC患者进行了回顾性研究。CD31-PAS双染色和IHC染色后，根据VM的数量及METTL3染色强度将病理组分为4个亚组:VM + /METTL3 +，VM−/METTL3 +，VM + /METTL3−和VM−/METTL3−。生存分析显示，双阳性组的存活率明显低于双阴性组。且METTL3染色强度与VM的数量也呈正相关。并对96例HCC患者进行了共表达分析。作责发现METTL3与上皮标志物E-cadherin的表达呈负相关，与VM标志物VE-cadherin、VEGFR1和VEGFR2（补充数据），间充质细胞标志物Vimentin，肿瘤VM微环境标志物，MMP2和MMP9呈正相关。此外，TCGA数据显示METTL3在364例肝癌患者中的表达与VM相关蛋白，CDH5、VIM、FLT1、KDR、MMP2、MMP9、FN1和SERPINE2呈正相关。另外，根据METTL3 mRNA表达情况将患者分为两组，即：METTL3高表达组和METTL3低表达组，两组之间的差异基因使用GSEA富集寻找METTL3相关通路。VEGFa信号通路被显著富集。这些数据表明，METTL3参与了肝细胞癌VM的形成且与预后不良密切相关。

➁ VM的形成受mRNA的m6A水平的调控

接下来，进一步探究m6A修饰与VM形成的关系。虽然多种细胞外配体和微环境可以诱导VM，但VEGFa被认为是HCC细胞中这一过程的主要诱导物。作者用VEGFa处理3D培养的HepG2和MHCC-97H细胞后，发现细胞成管能力明显提高，并且m6A / mRNA水平显著上升。同时，利用METTL3的siRNA降低m6A水平后，细胞成管下降能力，VE-cadherin表达受抑制，E-cadherin表达增加；而且，回复了VEGFa诱导E-cadherin下调和VE-cadherin上调。在细胞中过表达ALKBH5 (m6A去甲基化酶)后，m6A水平明显低于对照细胞，且成管能力较弱。以上数据表明，mRNA的m6A水平可能在体外调节肝细胞癌中VM的形成。

➂ Hippo通路参与m6A依赖性VM的形成

在明确了VM的形成受mRNA的m6A水平的调控后，作者进一步探索其机制。RNA-seq分析siNC组和siMETTL3组（3D培养后）的转录组差异，共鉴定出149个差异表达基因。将这些差异基因与GSE110320中m6A修饰的基因进行重叠，我们发现大部分（75%）差异基因的mRNA被m6A修饰。GO分析重叠基因，在癌症的恶性发展中起重要作用的Hippo 信号通路被富集。MeRIP数据的分析结果表明，在YAP1 mRNA中，m6A修饰的丰度较高，特别是在CDS区域。并且，MeRIP-qPCR结果显示，在敲除METTL3细胞中，YAP1 mRNA的m6A修饰水平显著降低。

➃ YAP1在体外通过m6A依赖方式促进VM的形成和癌症进展

接下来，作者进一步分析YAP1参与VM形成及其与m6A的关系。首先，通过WB检测了YAP1的表达，YAP1在使用siRNA敲降METTL3水平后表达下调，在过表达ALKBH5及VEGFa诱导后上调。此外，过表达YAP1可显著促进VM标记物VE-cadherin的表达，降低上皮标记物E-cadherin的表达；下调METTL3可显著挽救因YAP1过表达引起的VE-cadherin水平升高；并且YAP1显著增加VM的形成及增强细胞迁移和侵袭，而同时敲降METTL3后，细胞功能得以恢复。综上所述，YAP1在体外通过m6A依赖的方式促进VM的形成和肿瘤进展。

➄ m6A提高了YAP1 mRNA的翻译效率

前面发现YAP1的表达受到m6A水平的调控，那么，m6A修饰如何调控YAP1的表达呢？作者随后进一步研究了m6A甲基化调控YAP1表达的机制。敲降METTL3后，检测YAP1的pre-mRNA和mRNA表达水平，令人惊讶的是，干扰METTL3后YAP1的转录水平升高。然后我们用actinomycin-D（放线菌素）对细胞进行转录阻断。结果表明，METTL3干扰后，pre-mRNA和mRNA的半衰期明显延长。YAP1 mRNA水平与蛋白水平的不同步使作者怀疑m6A修饰可能与YAP1蛋白的翻译或稳定性有关。接着，用蛋白翻译抑制剂cycloheximide（环己酰亚胺）处理METTL3敲低细胞和相应的对照细胞。WB检测结果显示，两组实验蛋白的半衰期无明显变化。进一步采用双荧光素酶法测定YAP1蛋白的翻译效率，敲除METTL3后，YAP1蛋白的翻译效率显著降低。提示m6A诱导的YAP1表达与蛋白翻译的调控有关。用蔗糖密度梯度差速离心分离HepG2的总RNA，作者分析核糖体图谱，实验结果发现核糖体翻译起始复合物组装的显著减少，并且qPCR检测显示，siMETTL3细胞翻译激活多聚体状态下YAP1的mRNA水平明显降低。综上所述，m6A主要通过影响翻译效率来改变YAP1蛋白的表达。

➅ 沉默METTL3可抑制肝细胞癌原位移植肿瘤模型中VM的形成和肿瘤进展

体外机制探明后，作者接着采用原位肝癌移植肿瘤模型，研究m6A甲基化在肝癌转移和体内VM形成过程中的潜在影响。首先，将表达有sh-contorl和sh-METTL3 的SK-Hep1-Luc 细胞注射到裸鼠肝脏中。结果发现，在shMETTL3组，裸鼠全身和肺组织的荧光素酶信号受到抑制；Kaplan-Meier生存分析显示sh-METTL3裸鼠预后良好。并且，裸鼠shMETTL3的肿瘤病灶和VM计数显著低于对照小鼠。免疫组化染色分析显示在shMETTL3组，VM标记物VE-cadherin和其他参与VM 的蛋白MMP2，MMP9，Fibronectin的表达水平下降，同时，YAP1的表达也被抑制，而E-cadherin表达上升。综上所述，m6A甲基化在体内可促进肿瘤进展和VM的形成。

➆ m6A依赖性的YAP1表达在DEN诱导的Mettl3+/−肝癌小鼠模型中促进VM形成和肿瘤转移

为了进一步研究m6A和YAP1在体内癌症进展和VM形成中的作用，作者使用CRISPR-Cas9系统构建了Mettl3+/−C57BL6/J小鼠（敲除METTL3对胚胎是致命的，敲除了一个等位基因），可以发现，METTL3在小鼠肝组织中显著下调。随后，作者使用DEN（二乙基亚硝胺）处理小鼠，诱导HCC模型。造模成功后，一半的Mettl3+/−小鼠接受了治疗，将YAP1质粒注射入尾静脉即Mettl3+/−+ YAP1组，另一半Mettl3+/−小鼠用对照质粒，Mettl3+/−+Vector组，野生型老鼠用对照质粒，Wt + Vector组。实验结果发现Mettl3+/−+Vector组小鼠肿瘤病灶明显少于Wt +Vector组，而接受YAP1质粒注射后，减少的肿瘤病灶明显恢复。肺转移病灶及VM检测结果与此类似，相比于Wt +Vector组，Mettl3+/−+Vector组肺转移病灶及VM数量明显减少，而在接受YAP1质粒注射后，被恢复。免疫组化染色分析显示VE-cadherin，MMP2和MMP9的表达在Mettl3+/−+Vector小鼠中下降，而过表达YAP1挽救了敲除METTL3的影响。这些数据表明，在DEN诱导的Mettl3+/−肝癌小鼠模型中，敲除METTL3可以减弱其对癌症进展及VM形成的影响，而YAP1恢复了敲除METTL3的影响。

总结

在本研究中，作者发现m6A 甲基化酶 METTL3在HCC组织中的表达与VM呈正相关。VEGFa处理的3D培养细胞中m6A mRNA水平升高，与VM的形成及VM相关的标记物有关。RNA测序和功能研究表明Hippo通路参与了m6A介导的VM形成。m6A修饰可以促进YAP1 mRNA的翻译，激活Hippo通路。此外，m6A依赖的YAP1表达在体内外均可促进VM的形成、迁移、侵袭。作者研究结果表明，m6A修饰在HCC中VM的形成中起关键作用。METTL3和YAP1可能通过阻碍VM的形成成为抗转移的潜在治疗靶点。