12高通量测序-DESeq2文库标准化

DESeq2文库标准化

问题1：调整文库大小的差异

样本1的read是样本2的一半,样本2中每个基因的read是样本1的两倍。这种差异不是生物学造成的，而是测序深度造成的。RPKM，FPKM，TPM和CPM都处理这个问题。

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问题2:调整文库组成的差异：

RNA-seq(和其他高通量测序)经常被用来比较一种组织类型和另一种组织类型。例如，肝脏vs脾脏。这可能是因为肝脏中转录有很多肝脏特异性基因，而脾脏中却没有。这是一个不同的文库组成(library composition)的例子,你也可以想象，如果你敲除一个转录因子，在同一种组织类型中，你会发现不同的文库组成。

在这个例子中，两个文库有相同的大小(read)，现在，假设所有基因的表达都是一样的，只有一个例外。假设只有样本1转录A2M, 这意味着样本1中A2M消耗掉的563个reads,这563reads将会分布到样本2中的其他基因上。在样本2中，除了A2M之外，所有的reads都非常高。然而，唯一的差异表达基因是A2M。

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编写DESeq2(和edgeR)的人意识到他们的工具将用于各种类型的数据集，所以他们希望他们的标准化去处理:

• 问题1：调整文库大小的差异

• 问题2:调整文库组成的差异：

我们将从一个小数据集开始，说明DESeq2如何缩放(scale)不同的样本。目标是为每个样本计算一个标准化因子(scaling factor)。标准化因子必须考虑到read depth和library composition。

第一步：对全部值取log

• DESeq2使用了log(“以e为底的log”)

• DESeq2可以使用log2或log10，但在R中loge默认值。

• 注意log(0) =-∞，这是因为R定义log(0)等于-∞。

第二步：每行取平均值

• 任何时候你把一个数字加到无穷(或-无穷)你会得到无穷(或-无穷)，这就是为什么这是负无穷。因为Gene1是负无穷，所以平均值也是负无穷。

• 对数值的平均值有一件很酷的事情，那就是这个平均值不容易被异常值所影响。同理，我们可以看Gene3，存在异常值，取对数后，影响减小。

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第三步：过滤掉值为负无穷的基因

• 一般来说，这一步在一个或多个样本中过滤掉read为零的基因。

• 如果你在比较肝脏和脾脏，这将去除所有只在肝脏(或脾脏)转录的基因。

• 理论上，这有助于将标准化因子集中在管家基因上——无论组织类型如何，基因转录水平都是相似的。

第四步:从log(counts)中减去平均对数值

• 我们要检查的是每个样本读取数与所有样本均值的比。

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第五步:计算每个样本比的中位数(median)

• 注意:使用中位数是另一种避免极端基因在一个方向上过度影响的方法

• 表达差异较大的基因对中位数的影响并不比表达差异较小的基因大，因为具有巨大差异的基因极有可能是罕见的，因此，这种效应会给差异较小的和“管家”基因带来更大的影响。

第六步:将中位数转换为“正态数”，得到每个样本的最终的标准化因子

• 这些是对数值，所以它们是指数(这里是e的指数)

• 太棒了! !我们有三个样本的标准化因子，现在我们要做的就是把原始的reads除以它们。

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第七步：将原始reads除以标准化因子

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