Nanopore测序及数据处理
一、工作原理
新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）；采用电泳技术。
Nanopore测序当中的核心部件是这个由蛋白质构成的纳米级的小孔，我们称之为“Pore”。
这个蛋白质插在一层电阻率很高的薄膜当中。薄膜的两侧都浸没在含有离子的buffer当中。在薄膜的两侧加上不同的电位,离子就会通过蛋白质小孔，从膜的一侧移动到膜的另一侧，小孔当中就会有电流通过。当DNA的单链通过这个小孔的时候，就会对离子的流动造成阻碍。不同的碱基造成的阻碍大小是不一样的。这样，不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来。
（1）motor蛋白牵引DNA至nanopore并解链
（2）DNA的单链通过小孔的时候，会对离子的流动造成阻碍。
（3）不同的碱基所造成电流大小的波动，就被记录下来。
这些被记录下来的电流波动信号。经过分析，反推出原来经过小孔的是什么碱基。这就是Nanopore测序的基本原理。
二、实验设计
Nanopore的这层膜，现在是用的人工合成的一种多聚物的膜。膜上嵌入的这个蛋白，是整个测序芯片的核心。Nanopore公司给它起了名字叫“Reader”。用作Reader的蛋白，一般是天然能形成穿膜孔的跨膜蛋白，再经过基因工程进行改造，这样得来的。
Nanopore公司已经试过了很多种跨膜蛋白来做这个Reader。目前R9版的芯片用的是一个来自于大肠杆菌的叫CsgG的蛋白质。在把这个蛋白做了几百处基因工程改造之后，用作Reader蛋白。之前Nanopore公司还用过Hemolysin蛋白和MspA蛋白（来做Reader蛋白）。Nanopore公司每换用一种新的Reader蛋白，就给新的芯片起一个新的版本号。例如：R7、R8等。现在用的芯片版本号是“R10”。
R7.3，3KHz，6mers/event；
R9，4KHz，5mers/event；
在测双链DNA文库的时候，会用一个DNA解螺旋酶，来帮助解开DNA双螺旋，变成两条单链。以便其中一条单链能够穿过蛋白质小孔。这个DNA解螺旋酶，在这里也被称为“Motor”，就是动力（蛋白）的意思。
三、建库方法
1D文库测序，第1条DNA链测完以后，第2条链会脱离，后面也会测到，但是不会和第1条链对应上。
1D²文库，第1条DNA链测完以后，纳米孔会捕获互补链的马达蛋白进行互补链测序，但是互补链只是有一定概率能够紧接着被测序，两条链的数据相互校准，能够提高测序准确率（然并卵）。
此外， 2D的U型接头因侵权Pacbio，后弃用。
四、测序过程
Nanopore公司目前开发了几种测序仪：最大的是PromethION，一次可以承载48张芯片（GridIONx5，可以一次承载5张芯片；MinION，可以承载1张芯片；）
一张芯片上有2048个Mux（Mux是Multiplexer的简称）。Mux（Multiplexer）是“多路复用器”的意思。在Nanopore的芯片上，它也体现为一个物理的小孔。相邻的每 4个Mux形成一个小组。这一个小组的4个Mux共享一个信号放大器（Amplifier）。
一张芯片上有512个信号放大器，对应于512组Mux。在测序之前，机器会先把所有的Mux都通一下电，预测试一下。预测试完毕之后，机器就会知道每个小组当中，哪个Mux是最好的；哪个Mux是第二好的，再哪个是第三好的，哪个是排第四的。
在测序的时候，机器会先用每组当中最好的那个Mux进行测序；运行8小时之后，换第二好的那个Mux，再测序8小时，然后再换；依此类推，直到4批Mux都用完。（在测序的过程当中，目前一开始是先用180毫伏的电压。然后每10分钟，要短时间地颠倒一下电压的方向，让电流短时间地反向走一下。这样做，是为了激活一些被堵住的、或者被卡住的Pore（蛋白质小孔），让这些Pore能够重新工作。这样颠倒电压，也可能会让部分已进入Pore、但还没有走完的DNA链被吐回去。）
目前R9的芯片上，DNA链在Pore当中穿过的速度大约是每秒250个的碱基。所以10分钟能够测到全长为15万个碱基的一条单链（250 * 60 * 10 = 150,000）。
R9的芯片，开始测序的时候，是用180毫伏的电压。测序每进行2小时，要增加5毫伏的电压。这样做的原因是随着电极被用的时间越来越长，电极上的电压就会发生漂移。所以每2个小时，要增加5毫伏的电压来进行弥补。
Nanopore建议严格控制测序芯片的温度保持在34℃。
在实际的测序过程当中，并不是每个Mux都是有用的。据Nanopore公司公布的数据，2048个Mux当中，正常情况下会有1200个左右的Mux能够正常工作。
您将看到通道在捕获一条链（变为亮绿色）时闪烁，并在下一条链之前短暂返回到空状态（深绿色）。 您可能还会注意到一些pore偶尔会变成Recoving（深蓝色）,这是正常行为，软件会在可能的情况下自动重新激活它们。
其概括为：
1.Platform QC
2.散热片温度控温34℃
3.纳米孔使用情况
4.测序直方图
5.Local basecalling
五、碱基判读
Nanopore的碱基判读是一个复杂的工作。
因为目前蛋白Pore狭窄处的纵向长度，对应的是DNA单链上大约5个碱基的长度。所以在某一个时间点测到的电流信号，是这5个碱基共同作用的结果，而不是单个碱基的作用结果。这样就导致要从电流信号来判读碱基序列是一个复杂的过程。
目前Nanopore做碱基判读的算法 ，是既观察电流的大小，又观察电流大小的变化。通过机器学习的得到的复杂算法对碱基进行判读。
所谓的“机器学习”，大家听了也许会觉得特别深奥。我用通俗的话来说，就是“经验拟合”。
DNA分子通过pore时的电流变化统计，五个碱基为一组信号，获取电流大小及电流变化的波形图，通过软件的参数修正，与数据库中已知序列的波形图进行比对，对碱基进行判读。
把各种已知的碱基序列会给出的信号波形图，做成一个“图形库”。将新测到的未知序列的波型图，与现有的波形图库的去做比对，看哪个波型是比得上的。比对得上，那大体上就是那几个碱基。
在比对的同时，再加上许多的修正参数，以提高比对的准确性。而这些修正参数，是拿大量的已知序列、和测到的波型图进行对照。经过反复试错、加上统计分析，得到的一系列优化值。用软件程序，通过试错、和统计，得到这些修正参数值的过程，就是“机器学习”。
目前ONT的碱基判读，可以达到约85%~90%及以上。
六、数据处理
ONT的下机数据格式为fast5，需要通过basecalling相关软件，转化为fastq。basecalling软件ONT服务器自带，同时在不断更新中，有albacore、guppy、flip-flop等。
bascalling完的fastq数据，可进一步通过测序质量值过滤（官方推荐qual >7 or 11）.
质控后的数据可经过minimap2、ngmlr等长序列比对软件和基因组进行比对。
数据通量：保守来说，R9芯片的通量在40~70G左右；reads num在4M~7M不等，经过qual过滤在2~5M 条。
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