一文看懂10X VDJ
作者:童蒙
编辑:angelica
01.什么是BCR和TCR
B细胞和T细胞中发现的受体分别被称为B细胞受体(B Cell Receptor ,BCR)和T细胞受体(T Cell Receptor,TCR)。
B细胞受体与自由存在的可溶性抗原结合,而T细胞受体仅在主要组织相容性复合体(MHC)上识别抗原。
02.什么是BCR
BCR,称为B细胞抗原受体,是一种长在B淋巴细胞表面的免疫球蛋白分子(IG)。它的结构包括2条重链(IgH)和2条轻链(Igκ和Igλ)。
- 重链包含了一个可变区(VH)和3个恒定区(CH1/CH2/CH3)。
- 重链恒定区:免疫球蛋白有IgA、IgG、IgM、IgD、IgE五种,各自可以搭配κ或λ两种轻链,而重链的恒定区决定它是哪一种球蛋白
- 重链可变区:分为骨架区和互补决定区
骨架区:变化相对较小,有4个,分为FR1、FR2、FR3、FR4
互补决定区:变化相对较大,有3个,分为CDR1,CDR2、CDR3,其中CDR3的变化最大。 -
决定恒定区的基因为C基因,而可变区的基因为V基因、D基因和J基因,如下图:
- 轻链包含了一个可变区(VL)和一个恒定区(CL);一个天然的Ig分子两条轻链总是相同的。
- 轻链恒定区:决定了搭配重链的是两种轻链中的哪一种
- 轻链可变区:分为骨架区和互补决定区
骨架区:变化相对较小,有4个,分为FR1、FR2、FR3、FR4
互补决定区:变化相对较大,有3个,分为CDR1,CDR2、CDR3,其中CDR3的变化最大。 - 决定恒定区的基因为C基因,可变区的基因为V基因和J基因,如下图。
为什么说CDR3的变化最大呢?CDR3和V、D、J有什么关系呢?
大家看下图,可以看出V、D、J在CDR3区是重合的,所以CDR3的组成是由三个基因构成的,因此变化最大。
总之:BCR整体的结构如下图:
03.什么是TCR
T细胞受体(T cell receptor,TCR)是T细胞表面,负责特异性识别与MHC(主要组织相容性复合体)结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时,T淋巴细胞通过信号转导被激活,进入后续的免疫应答过程。人类基因组中有4个TCR基因:
- 两个编码轻链TCR:TRA基因编码TCRα,TRG基因编码TCRγ;
- 两个编码重链TCR:TRB基因编码TCRβ,TRD基因编码TCRδ;
重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体,组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR:
- TCRα/β,95%的T细胞表达TCRα/β,称为αβ T细胞;
- TCRγ/δ,5%的T细胞表TCRγ/δ,称为γ/δ T细胞
该比例在个体发育过程中和患病状态(例如白血病)中发生变化,物种之间也有所不同。
同BCR类似,TCR也是由重链和轻链组成,以α和β为例介绍:
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重链 :由一个可变区(V区)和 一个恒定区(C区),同Ig类似,可变区也是由V、D、J基因组成,也有3个CDR区,其中CDR3区变化最大,如下图:
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轻链:由一个可变区(V区)和 一个恒定区(C区),同Ig类似,可变区也是由V、J基因组成,也有3个CDR区,其中CDR3区变化最大,如下图:
04.为什么TCR和BCR会多种多样呢
举IGH的例子,编码IGH可变区的胚系基因分为V、D、J三种基因片段,其中V基因片段有44个,D基因片段有27个,J基因片段有6个。
在基因重排发生时,B细胞(生理或病理状态下)分别从V、D、J基因片段中各挑1个,组成V-D-J耦合基因。计算一下这样排列组合的方式有几种?44x27x6大约有6000多种,加上轻链的话,排列组合的方式更多,计算如下表。这就组成了IG和TCR的多样性。
05. 10X VDJ的实验流程
10X 转录组的流程想必大家已经了解了,不了解的可以看我们之前的推文,下边的干货文章不容错过哦~
单细胞分析集锦
- 单细胞转录组(Single cell RNA)概述
- 单细胞转录组亚群分析
- 单细胞转录组高级分析介绍
- SpatialDB引发的10x技术原理的探究
- 不可错过的单细胞转录组研究新维度:空间转录组
- 认识膀胱细胞——单细胞水平比较Human和Mouse的不同
那么10X VDJ的流程给大家介绍下:
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第一步,利用油包水的结果,分离单细胞,捕获mRNA,并进行裂解。
- 在每个GEMs中,对mRNA进行捕获,加上barcode和UMI,裂解单细胞后,进行混合成bulk样品。
- 混合后的样品,分成三份,一份做mRNA测序,一份可以用来TCR富集,一份用来做BCR富集。
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对于TCR或者BCR而言,使用多重PCR进行扩展和富集,如下图。
- 对文库进行测序,测序文库结果如下,Read1和Read2测150bp,需要测通。每个细胞推荐测5000对序列。
06.标准分析流程
使用的软件是cellranger,命令是mkfastq和vdj。下面我们来介绍下细节。
mkfastq命令为:cellranger mkfastq --id=tiny_bcl --csv=my_samples.csv --run=/mnt/hiseq/tiny_bcl
结果为三个fastq文件,两个reads,一个index的。
vdj命令为:cellranger vdj --id=sample345 --sample=sample1 --reference=refdata-cellranger/GRCh38 --fastqs=my_fastqs
会出来一堆的结果,如下图:
总结
今天给大家介绍了TCR和BCR,以及10x genomics vdj的实验和分析原理,希望大家喜欢。
参考文献
https://www.jianshu.com/p/5df85f7a3524
https://www.jianshu.com/p/1d95d9a2561f
https://cloud.tencent.com/developer/article/1635484
http://seqhealth.cn/list/26.html