【文献分享】配体诱导的病原菌模式识别受体的寡聚化

这次分享一篇2014年发在《PNAS》上的Chitin-induced activation of immune signaling by therice receptor CEBiP relies on a unique sandwich-type dimerization。主要介绍了真菌细胞壁成分chitin诱导的CEBiP的同源二聚化，及与CERK1的异源二聚化。

Abstract

MAMP介导的免疫(PTI)在植物免疫中发挥了重要的作用。本文主要是为了阐明水稻中的PRR--CEBiP受体复合物的形成和激活机制。核磁共振光谱的表位定位显示了长链几丁寡糖如七聚八聚体优先与CEBiP结合，并且N端的乙酰基对其结合的重要性。分子建模/对接研究阐明了CEBiP和几丁质寡糖之间的分子相互作用，并表明Ile₁₂₂在中央赖氨酸基序区域对配体结合的重要性，这一观点得到了位点定向诱变的支持。

Results

1.Functional Dissection of the Ectodomain of CEBiP

评估之前报道过的CEBiP上的两个Lys结构域(L1和L2)对结合chitin的贡献，构建了三种类型的突变体，缺L1，缺L2，同时缺L1和L2，在烟草细胞BY-2中瞬时表达，使用带生物素标记的chitin(GN8-Bio)进行结合验证。结果发现，缺L1的CEBiP能正常表达，而其余两个不能正常表达，说明缺L2影响了CEBiP的正常表达；有意思的是，缺L1的CEBiP不能够结合chitin，但其余两个仍可以结合chitin。这就说明LysM1对于CEBiP结合chitin很重要。

为了深入的了解LysM对于结合chitin的贡献，我们构建了嵌合受体。CEBiP(L2 →L1)[LysM2被LysM1所替代]和CEBiP(L1 →L2)，在烟草中瞬时表达，结果发现，CEBiP(L1 →L2)正常表达，而CEBiP(L1 →L2)不能正常表达；CEBiP(L1 →L2)不能结合GN8-Bio，而CEBiP(L1 →L2)能结合GN8-Bio。进一步确定了LysM1对结合chitin的重要性。

隐马可夫模型预测还存在第三个LysM结构域，LysM0。于是我们想检查该结构域对结合chitin的贡献。不幸的是，删除该区域，在烟草中不能表达，因此将LysM0拆分为四个区域(L0a-L0d)，除了L0a不能正常表达外，其他的三个突变体都能正常表达且能结合GN8-Bio，且Loc表现出对chitin最强的结合活性。

构建一系列CEBiP胞外域的C端缺失的突变体，结果发现C端缺失并不影响CEBiP的chitin结合活性。

2.STD NMR Epitope Mapping of Chitin Oligosaccharides in the Presence of the Ectodomain of CEBiP

NMR用于绘制几丁质寡糖的相互作用表位，揭示CEBiP的LysM结构域与chitin相互作用的分子机制。NMR发现，LysM结构域对不同大小的配体具有不同的结合活性。我们发现(GlcNAc)₈和七庚糖与CEBiP互作，乙酰基基团引起了最高的STD效应，说明这部分在CEBiP与LysM1-2结合的过程中起着基础性作用，而质子H2_m、H3_m、H5_m同样对相互作用起着重要作用。

因此，通过NMR分析得到的结合表位明确支持CEBiP利用其LysM结构域识别并结合几丁质寡糖，对长链底物表现出强烈的偏好，尤其是七糖和八糖。

3.Docking Model of Chitin Oligosaccharide with LysM1 Domain of CEBiP

分子模拟试验发现，在LysM1结构域的结合裂缝中可以容纳四个GlcNAc片段。由STD NMR数据显示，寡糖的外部糖基对结合几乎没有贡献，因此可以推测，饱和于LysM1上四个结合亚位点的最小寡糖为(GlcNAc)₆。分子模拟还揭示，除了乙酰基团介导的氢键外，(GlcNAc)6结合主要通过糖环碳的疏水相互作用稳定，这一发现与我们的STD NMR结果非常一致

4.Assessing Key Residues Involved in Chitin Binding

通过分子模拟鉴定到三个疏水残基(Pro₁₁₉,Ile₁₂₂,Val₁₂₄)可能涉及到chitin的结合。在这三个残基中，Ile₁₂₂在假定的结合缝隙的中央部分，我们推测它可能对于寡糖的结合有重要作用。把Ile₁₂₂突变成Ala，并不改变结构的完整性，但不能再结合七庚糖。比对同源物发现，AtCEBiP和MtLYM2也携带Ile₁₂₂这个位点。

进一步分析脂族侧链在几丁质结合中的贡献，我们用Val或Leu替代Ile₁₂₂，通过亲和标记分析了GN8-Bio与突变蛋白的结合,替换带Leu的Ile₁₂₂与GN8-Bio保持相似甚至更高的亲和力,而替换成Val则显著降低了亲和力。这说明，这些氨基酸残基脂肪侧链的长度是与几丁质寡糖相互作用的关键因素。

5.Binding of (GlcNAc)8 Dimerizes the Ectodomain of CEBiP.

用(GlcNAc)₈孵育前后LysM1-2样品进行光散射实验测定,发现(GlcNAc)₈诱导了LysM1-2大小分布的显著增加，平均分子直径从6.12nm增到了12.45nm，平均摩尔质量也从11.68KDa增到了22.61kDa。这些结果说明LysM1-2在有(GlcNAc)₈存在时，发生二聚化。

6.A Unique Oligosaccharide, (GlcNβ1,4GlcNAc)4 Acts as an Antagonist for the Binding of GN8-Bio, (GlcNAc)8-Induced Dimerization and Reactive Oxygen Species Generation.

个人感悟
1.虽然是水稻的基因，但是都是在烟草体系中做的，暗示我们烟草可能是一个好的表达系统，得好好利用。
2.将一些化学的手段(如NMR)引入平时的试验中可以提高逼格。
3.讲清楚一个故事就很厉害了。

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