如何避免限制消化反应的几个常见问题

我们列出了几种限制消化常见问题，并解释了如何确定并解决它们以帮助您改进结果。

问题1.由于酶失活，导致酶消化不完全或无法消化

由于限制酶可能储存或处理不当而失去活性，重要的是始终检查有效期，确认酶已储存在-20°C，并检查冷冻箱的温度（不允许温度超过-20°C，因为多次冻融循环（超过3次循环）可能导致酶活性降低）。

使用1μg标准对照DNA（例如λDNA）建立对照反应，测试酶的活性，其中您知道DNA质量高且具有预期的条带模式。

避免将酶储存在经受温度波动的无霜冻结器中。还建议将酶保持在冷藏室的冷藏架中，因为这有助于稳定储藏温度。

问题2.由于反应条件不理想，不完全消化或不消化

如果消化对照DNA没有问题，那么您的反应可能会有其他问题。要评估适当的反应条件，请按照下列步骤操作：

1.确认您使用的反应缓冲液，包括产品支持材料中指定的任何添加剂。

2.确保你使用分子生物学级别的水。

3.确保限制酶是添加到反应混合物中的最终组分，并且最终的甘油含量低于5％，使得酶体积小于总反应体积的十分之一。

4.仔细检查所用酶的最佳反应温度，并控制孵育过程中的蒸发，因为缓冲液中盐浓度的增加会抑制酶的性能。

如果反应参数都是正确的，请考虑模板DNA：

1.在最终的反应混合物中最佳的DNA浓度在20-100ng /μL之间。

2.DNA底物不应含有污染物或反应组分，如SDS，EDTA，蛋白质，盐和乙醇。

问题3.由于DNA甲基化阻断的酶活性，不完全消化或不消化

如果你的酶是活性的，消化对照DNA并且反应是使用最佳条件设定的，但你仍然看到消化问题，这可能是因为酶被模板DNA的甲基化所抑制。几种内源性甲基化酶位点特异性甲基化腺嘌呤（DAM）或胞嘧啶（DCM）残基并可影响酶活性。

例如，通过脱氧腺苷甲基化酶（DAM甲基化）的甲基化通常在GATC序列的大肠杆菌中发生。该序列与一些酶的识别位点重叠，如BamHI和BclI。在这种情况下，BamHI在存在或不存在甲基化的情况下切割DNA，而BclI不能切割甲基化的DNA。

为了克服这种限制，您可以将质粒DNA转化为dam-minus，dcm-minus菌株，如大肠杆菌 GM2163。这些甲基化阴性菌株不会干扰甲基化。

问题4.由于底物DNA的结构不完整或不消化

PCR片段：

PCR产物的不完全消化或不消化可能是由于识别位点接近DNA片段的末端。一些限制性内切酶需要额外的侧翼碱基来进行有效的DNA结合和切割。

由于识别位点通常在PCR片段或引物的末端被引入，因此了解需要多少碱基位点才能实现最佳切割是很重要的。

酶供应商通常提供表格，说明从识别位点末端应该存在多少碱基以获得最佳活性。

例如，即使识别位点位于片段的末端，PasI也可以切割DNA，而PaeI需要至少5个额外的碱基才能进行最佳消化。

质粒DNA：

如果您试图在多克隆位点使用两种酶进行双重消化，如果两个识别位点过于接近，则高效切割可能会很困难。一种酶可以物理阻断第二种酶进入其相应位点。

无效裂解也与先前描述的识别位点接近DNA末端有关。一个酶切割后，可能没有足够的碱基位于第二个位点的第二个位点上，以便第二个酶结合并影响切割。

出于这些原因，如果可能的话，选择进一步分开进行克隆的限制性位点。但是，如果您必须使用距离很近的站点，请考虑按顺序进行消解。而且，在建立反应之前，确定哪种酶在切割接近DNA片段末端时更有效，然后使用该酶。

在这个例子中，XbaI和SalI在pUC19多克隆位点（MCS）中彼此相邻。

如果你先用XbaI切割，SalI只能以高达20％的效率切割。

但是，如果您先用SalI切割，则XbaI可在切割线末端切割，效率高达100％。出于这个原因，您应该进行连续反应并用SalI消化，然后用XbaI来制备用于克隆的质粒。

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