研究思路 | 单细胞ATAC+基因表达多组学研究思路怎么破，一起
单细胞转录组测序（sc RNA-seq）能够解释细胞的转录状态和表达情况，单细胞染色质可及性测序（sc ATAC-seq）能够揭示基因表达相关的染色质开放状态和调控景观，二者同时应用能够将基因表达与调控元件的可及性联系起来，更准确地重建细胞生理学基础的分子过程。利用单细胞ATAC和单细胞基因表达的多组学结合的研究模式逐渐成为CNS文章的“标配”，已被广泛应用于肿瘤、疾病、神经科学、发育生物学及免疫等研究领域，引领着未来单细胞发展的主流趋势。
如果把sc RNA-seq和sc ATAC-seq比作两个角色，单细胞多组学的文章比作舞台的话，那么，二者既可以同时处于“C位”，深度配合，相辅相成；也可以分“主角”和“配角”，以sc RNA-seq为主、sc ATAC-seq为辅的方式完成配合。从而完成解析生物进程中的基因表达模式的动态变化及其背后调控机制的共同目的。接下来就分两期介绍以上两种单细胞多组学研究模式。本期我们先来看二者共处“C位”的模式，这种研究思路究竟是怎么样的呢？
表1 2021单细胞ATAC+基因表达部分文章集锦
由转录因子（TF）结合变化驱动的顺式调控DNA元件活性的动态变化，是发育过程中表型转变的基础。单细胞ATAC和单细胞转录组联合使用能够将基因表达与调控元件的可及性联系起来，有助于研究TF组合如何驱动基因表达的程序，具有量化调控元件的动态活性及推断疾病相关基因变异影响发育的时间点或细胞类型的潜力。
该研究中，研究者从妊娠中期8周的人类胎儿大脑皮层（或叫皮质）样本中分别生成了单细胞染色质可及性图谱和RNA表达图谱，并使用单细胞多组学测序技术（sc Multiome-seq，即对同一细胞同时进行单细胞可及性和单细胞转录组测序和分析）验证了这些发现。
1. 材料方法
妊娠中期8周的人类胎儿皮质样本，共PCW16、PCW20、 PCW21和PCW24四个时期，其中8个样本进行sc RNA-seq，13个样本进行sc ATAC-seq，3个样本进行sc Multiome-seq。
2. 研究思路
3. 研究结果
（1）为捕捉大脑皮层中的细胞异质性，分别生成了大脑皮层发育过程中的单细胞基因表达图谱（57,868个单细胞转录组）和染色质可及性图谱（31,304个单细胞表观基因组）。基因表达和染色质可及性的聚类结果高度相似，其匹配细胞类群的注释也几乎一致。将基因远端顺式调控元件（CRE）可及性与基因表达联系起来，确定了64,878个代表潜在增强子－基因相互作用的CRE-Gene对，并得到185个可根据染色质可及性程度预测表达水平的基因（GPCs）。来自同一细胞的单细胞多组学基因表达和和染色质可及性（sc Multiome-seq）的结果也验证了以上发现。
（2）构建谷氨酸能神经元（GluN）发育轨迹，以便查找神经元特化、迁移和成熟过程中的基因表达调控机制和网络，发现早期和晚期时间点与成人皮质深层和浅层的显著关联。关注GluN中的CRE-Gene对，发现早期活跃的连锁基因富集在细胞分裂和神经前体增殖等通路，后期活跃的连锁基因与形态发生、迁移和成熟有关。调控机制研究发现动态调节因子表达和Motif活性随发育拟时间同步变化。该研究数据描述了皮质发生过程中连贯的Motif活性波动变化，这些变化在整个妊娠时间点上是一致的。
（3）划分共表达基因模块，检测其在不同细胞簇、发育阶段和拟时间中的表达情况，通过模块间的相似性，研究各模块之间的发育分化关系，发现了三个周期相关的程序。其中一个程序揭示了一种有分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞潜力的多能神经胶质细胞的存在。通过染色质可及性和基因表达谱还鉴定了两个星形胶质细胞的前体细胞群。此外，通过关注表达细胞周期信号强烈相关基因模块的细胞间异质性，研究者还探究了祖细胞的染色质状态如何潜在地影响具有更多分化细胞状态特征的表达程序，这些程序可能代表了不同的细胞命运。
（4）最后，研究者构建基于基因表达和和染色质可及性的深度学习模型，将DNA序列与染色质的可及性联系起来，并通过该模型发现一个位于NFIA的个内含子的破坏性突变，该基因的功能丧失突变此前已被认为与自闭症有关。
4. 总结
该研究选取不同妊娠时期的胎儿大脑皮层样本，分别构建了人类大脑皮层基因表达和染色质可及性图谱，发现了二者在细胞组成上的一致性；然后结合sc RNA和sc ATAC两套数据重建了GluN的发育轨迹，揭示了在GluN分化成熟过程中基因远端顺式调控元件（CRE）调控基因表达（Gene）的机制；最后划分共表达基因模块，继续结合sc RNA和sc ATAC数据解析CRE-Gene对在不同细胞簇、发育阶段和拟时间中的表达情况，并发现及鉴定了两个星形胶质细胞的前体细胞群。文章通篇使用sc RNA和sc ATAC两套数据共同展开分析和论述，没有区分谁是“主角”谁是“配角”，完美实现了解析人类胎儿大脑皮层发育过程中染色质和基因调控的动态机制的研究目的。
人脑由多个异质的细胞亚群组成，神经元和非神经元细胞协同工作，协调着不同细胞类型的生物过程。无论是健康还是疾病状态，大脑各种生理过程的基因调控都是高度复杂和动态的。精确定位复杂疾病的致病机制需要在表观基因组和转录水平上对细胞类型特异性基因调控系统有严格的理解。
阿尔茨海默症（AD）等神经退行性疾病以大量神经元丢失为特征并伴有胶质增生，但特定神经元和胶质细胞类群在AD病理生理学中的作用尚不清楚。该研究对来自晚期AD患者死后和认知健康对照脑前额叶皮层同时进行单细胞核转录组测序（sn ATAC-seq）和单细胞核ATAC测序（sn RNA-seq），确定了细胞类型特异性、疾病相关的候选顺式调控元件及其候选靶基因，提供了AD分子变化更为完整的理解。
1. 材料方法
选取认知健康对照和AD患者死后的大脑前额叶皮质组织，其中11个晚期AD患者和7个对照进行sn RNA-seq，12个晚期AD患者和8个对照进行sn ATAC-seq，还对大量对照和早期AD患者、晚期AD患者进行Bulk RNA-seq。
2. 研究思路
3. 研究结果
（1）利用sn ATAC-seq（130,418个单核表观基因组）和sn RNA-seq（61,472个单核转录组）发现了大脑所有主要的细胞类型，包括兴奋性神经元（EX）、抑制性神经元（INH）、星形胶质细胞（ASC）、小胶质细胞（MG）、少突胶质细胞（ODC）和少突胶质祖细胞（OPC）。与对照样本相比，晚期AD中的细胞类型组成有明显改变（如ASC3显著增加，而ASC4显著降低）。远端和近端差异染色质可及区域以及差异表达基因的GO富集显示高度的细胞类型特异性。
（2）关注了AD晚期顺式基因调控，鉴定了11,440个候选顺式调节元件（cCRE）和56,552个Gene-cCRE关联对（gl-cCRE）。研究发现细胞类型特异性的Gene-cCRE对和在多种细胞类型中共享的Gene-cCRE对。比较对照和AD患者的差异，确认了cCRE在疾病相关基因表达变化中的关键作用。通过构建特定细胞类型的TF调控网络，发现在晚期AD中起作用的转录因子（如转录抑制因子SPI1）。
（3）构建了疾病相关胶质细胞的综合轨迹，探究细胞状态转换连续的基因表达、染色质可及性和TF调控模块的动态变化，进一步揭示了AD细胞异质性的分子机制。分别对少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞进行拟时序分析，发现了各自的细胞类型异常变化的转录因子及其潜在调控机制。如在少突胶质细胞发现两个关键转录因子：核呼吸因子1（NRF1）和固醇调节元件结合转录因子1（SREBF1），NRF1在轨迹的末端与靶基因负相关，而SREBF1在轨迹的开始和结束都与靶基因正相关，表明SREBF1在整个轨迹中充当转录激活因子。
（4）关注了AD相关多态性沿小胶质细胞拟时间轨迹变化，发现基因远端峰的富集显著增加，而近端峰显著降低，表明疾病相关小胶质细胞（DAM）远端增强子上可能具有与AD相关的SNPs。少突胶质细胞的单核一致加权基因共表达分析（sc WGCNA）发现了四个与AD诊断显著相关的共表达模块OM1、OM2、OM4和OM5，其中三个少突胶质细胞模块显著富集了SREBF1的靶标，表明SREBF1在调节这些模块中的基因表达方面的重要性，可作为AD治疗的候选靶点。
4. 总结
该研究选取认知健康对照和AD患者死后的大脑前额叶皮质样本，对人前额叶皮质进行基因表达和染色质可及性分别分群分析和联合分析，结果说明单组学和联合分析细胞类型的一致性，且发现了AD细胞异质性的多组学特征；然后结合sn RNA和sn ATAC两套数据深入探究AD相关的调控机制，进而确定了细胞类型特异性、疾病相关的候选顺式调控元件及其候选靶基因，发现了在晚期AD中起作用的转录因子；此外，研究还结合两套数据构建了疾病相关胶质细胞的综合轨迹，探究细胞状态转换连续的基因表达、染色质可及性和TF调控模块的动态变化，进一步揭示了AD细胞异质性的分子机制；最后，研究采用sc WGCNA对AD转录组进行系统级分析，并证明其在确定新的疾病基因靶点方面的实用性。文章使用sn RNA和sn ATAC两套数据深入结合进行探讨，亦没有区分谁是“主角”谁是“配角”，为了解疾病发病机制背后的细胞异质性和调控机制的深入探究提供了独特的视角，是非常值得借鉴的机制研究思路。
参考文献
1. Trevino AE, Müller F, Andersen J, et al. Chromatin and gene-regulatory dynamics of the developing human cerebral cortex at single-cell resolution[J]. Cell, 2021, 184(19):5053-5069.e23.
2. Morabito S, Miyoshi E, Michael N, et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease[J].Nature Genetics, 2021, 53(8):1143-1155.
