测序原理

一代测序

sanger测序：双脱氧链终止法
由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP，得到片段大小不一致的DNA混合物，然后通过凝胶电泳分离和放射自显影后识别确定待测分子的DNA序列。
特点：金标准，人类基因组计划应用一代测序完成

二代测序

Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和Life technologies（ABI）公司的SOLiD技术；Life technologies公司的Ion Torrent和Ion Proton技术等，经过不断的竞争，454、SOLiD 和Helicos平台不再开发新的仪器，Illumina平台最终成为市场主流，其方法为边合成边测序。

1.DNA文库构建
将基因组DNA随机片段化，然后通过末端修复、磷酸化、加A等步骤修补成平末端，最后加上特定的接头（Adaptor），构建成DNA文库。
2.簇的生成——桥式PCR
Flowcell ：流动池，就是一张芯片，如Hiseq2500有2张flowcell，即一次运行的测序量
Lane：每张flowcell上通常都有多个通道，每个通道可以单独测不同的样品。
Flowcel上面连有两种接头（P5、P7），当DNA经变性后流经Flowcell时，利用Flowcell上的接头与DNA两端的接头相互匹配。DNA进行桥式PCR扩增，从而将碱基信号放大。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段。
3.测序
4.数据产出
特点：通量高、时间短、读长短。

index测序 测序总结

三代测序

单分子测序技术原理
SMRT技术：
也采用边合成边测序方法，以SMRT芯片为测序载体，芯片上众多小孔中的DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记4种碱基（dATP,dTTP,dCTP,dGTP)，在碱基配对阶段，加入不同碱基会发出不同的光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。另外，若碱基存在修饰，则通过聚合酶的速度会减慢，因此可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间、两峰之间的距离来检测甲基化等碱基修饰情况。SMRT测序速度快（每秒约数个dNTP），但是，测序错误率也较高（达到15%，可通过多次测序进行有效的纠错）。

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Complete Genomics公司的复合探针-锚定连接技术：
这项技术有点像升级版的SOLiD系统，但比之更复杂，这次是一次性结合9个碱基，只有第五个碱基是确定的A、T、C或G，而其他8个碱基则是随机的。所以每个探针的长度是9个碱基，荧光种类还是4种，有每个探针的第五个碱基的种类确定。具体过程如图。
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纳米孔单分子测序技术：
纳米孔测序理论自1989年被提出以来，历经近三十年的发展，终于从理论到商业化并得到越来越广泛地应用。该技术的原理是当在膜两侧施加电压，分子马达驱动DNA分子通过纳米孔，导致电荷发生变化，每种碱基引起的电流变化是不同的，通过检测这些电流进而转化为对应的碱基序列。
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Ion Torrent电子流检测技术
这也是新一代测序技术中并不用到荧光检测的一种，它检测的是在合成过程中，不同碱基加入而释放出的不同强弱的离子流。
特点：无需PCR扩增，读长长，精准、高效 总结（来自生信星球）