16.GPCR功能之磷酸化ERK检测
2.2.4丝裂原激活蛋白激酶
细胞表面受体的激活可导致多种信号通路的激活,其中许多通过相关的MAPK级联,最终使得ERK1/2磷酸化而激活。Gq偶联受体通常采用Ca2 +依赖或非依赖的方式通过PKC激活ERK1/2和/或PLCβ。Gi / o 偶联受体一般通过βγ亚基调解磷酸化ERK1/2 (pERK1/2)。Gs活化ERK1/2通常依赖cAMP/PKA/ B-Rafs机制实现。测量多个途径共同效应的靶标,而不是指向某个特定的G蛋白亚型,增加了发现更多激动剂的可能性。受体功能的读出被放大,而不是偏向于一个特定的途径,有检测微弱的部分激动的倾向,否则可能会错过。关于ERK1/2,市面上有一种非常特殊的抗体,可以使用Western blot和ELISA测定双pERK1/2的相对水平。ERK1和ERK2分别在Thr202/Tyr204和Tyr185/Thr187位点磷酸化。在Western blot中,pERK1和pERK2由于大小不同,可以根据电泳迁移率进行分离;因此,pERK1或pERK2的变化可以相互独立地评估。然而,这两种技术都是劳动密集型和耗时的,需要多个洗涤步骤。
目前,一系列基于电化学发光 (MSD,Gaithersburg,MD),红外荧光 (LI-COR,Lincoln,NE) 和AlphaScreen technology (PerkinElmer, Boston, MA)的相对高通量分析方法被用来检测pERK1/2。基于Alpha Screen的SureFire细胞内ERK1/2检测系统(TGR Biosciences, Adelaide, Australia)利用双抗体系统,其中一个抗体靶向 pERK1/2,另一个抗体结合一个固定的表位。只有磷酸化的ERK1/2会被两种抗体结合;所以,这个系统只有在pERK存在的情况下,才使得beads靠得足够近,产生能量传递。这个方法对于胞内表达和转染产生的ERK1/2 磷酸化都适用。而且,这一方法与其他高通量方法相比,不需要多个洗涤步骤或细胞固定。
2.3 注意事项
•成功的分析方法往往取决于表达你感兴趣GPCR的细胞。为保证检测的稳定性,GPCR的表达水平要适中,在检测的背景活性要尽可能的小。GPCRs既可以在稳定的细胞系中表达,也可以通过瞬时转染细胞来表达。瞬时转染可以产生高表达水平,因此,对背景有更高的信号,而稳定的细胞系对于大规模的筛选活动非常重要,因为细胞系需要反复测试。GPCR在细胞系中的表达水平通常可以通过放射配体结合测定来确定。转染后的受体DNA结构也可以被修改,以包含一个由抗体识别的表位来决定表达。
•GPCR与G蛋白的偶联谱可以是细胞系依赖的;因此,在可能的情况下,有必要观察多个受体功能的输出,或观察各种细胞背景下的功能。
•细胞系中GPCRs的过表达可通过非生理途径导致偶联。在研究GPCRs的基础生物学及其信号通路时,这是一个特殊的问题。然而,这种现象,再加上使用混杂的G蛋白可以与任何受体结合,导致了GPCRs超高通量筛选的发展,这里面唯一检测的是受体的激活或抑制。
•细胞密度在所有检测中都是一个关键因素,必须针对每种情况进行优化。细胞密度不仅会影响信号强度,还会影响检测到的背景噪声水平。
•与所有的检测一样,阳性和阴性对照的设置是至关重要的。所有实验中的重要对照包括基础水平的测定、待测物溶剂添加的影响以及使用与GPCR无关的方法——如通过内源性表达的GPCR或者非受体介导的——激活第二信使,例如,通过forskolin直接激活ACs。
•GPCR过表达可导致高水平的组成型活性,从而降低信号窗口,或可能导致信号通路的下调。另一个值得关注的是信号放大的影响,由于受体储备的影响,所有被检测的激动剂都可能表现为完全激动剂。使用拮抗剂/反向激动剂可降低GPCR活性的基础水平,从而提高信噪比。受体烷化可能被用来减少激动剂的结合位点数量,并可能随着受体储备的减少而检测出部分激动剂(与完全激动剂相对)。