全长16S：细菌的“第二代身份证”
16S rRNA基因一直被作为微生物群落中细菌“身份”的分子标记。通过对16S rRNA基因特定区域进行扩增和测序，可以研究环境样品中微生物群落组成以及相对丰度。随着测序技术的发展，读长更长的三代测序技术被用到16S扩增子测序中。相比于基于短读长测序技术的16S扩增子测序，基于PacBio等三代测序技术的扩增子测序可以实现对16S rRNA基因全长序列的高精度测序，从而实现更准确的群落组成鉴定。因此，可以说全长16S扩增子测序是细菌的“第二代身份证”。
一、16S rRNA基因：细菌的“身份”标志
16S rRNA基因（16S rDNA）编码原核生物核糖体小亚基rRNA，长度约为1542bp，包含10个保守区和9个高变区。16S rRNA基因一直被作为细菌系统分类学研究中最常用和最有用的分子标记，是因为其具有以下优势：
1. 广泛存在于所有原核生物中
编码原核生物核糖体小亚基rRNA，因此在所有原核生物基因组中均存在。
2. 具有足够的系统发育信息
同时具有保守区和可变区，保守区在物种间差异不大，反映了物种间的亲缘关系；高变区具有属或种特异性，能体现物种间的差异。
3. 易于扩增
长度仅为1542bp，而且保守区为扩增提供了良好的引物结合区域。
4. 信息数据库全面
Greengenes、Silva和RDP等数据库为基于16S序列的物种注释提供了全面的分类信息。
二、全长16S扩增子测序的优势
与二代短读长测序技术相比，PacBio长读长测序技术具有许多明显优势，这些优势为基于16S序列的物种注释提供了更准确和全面的信息。
1. 长读长
二代测序读长仅为几百bp，而PacBio测序读长可达几十甚至上百kb。对于长度约为1542bp的16s rRNA基因，二代测序只能用于对16S rRNA基因的部分区域进行测序，而PacBio测序可轻松跨越16S rRNA基因的全长序列；
2. 测序过程无PCR
二代测序过程中的PCR可能引入人为的碱基错误，而PacBio测序直接进行单分子实时测序，避免了PCR过程中的人为错误；
3. 高碱基准确性
PacBio HiFi Reads碱基准确性高达99%以上。物种注释时是基于OTUs序列的一致性，因此测序准确性对准确的物种注释非常关键。
与基于短读长的二代16S扩增子测序相比，基于PacBio的全长16S扩增子测序在微生物多样性研究中的优势包括：
1. 提高物种注释准确性和分辨率
与16S部分区域的扩增和测序相比，PacBio全长16S扩增子测序是对16S rRNA基因的全长序列进行扩增和测序。全长序列能为物种注释提供更全面和准确的信息。PacBio全长16S扩增子序列的分析一方面可以注释到更多的OTU，显著提高注释物种的准确性，另一方面可以提高物种注释的分辨率，实现“种”水平的物种注释。
图1 部分和全长16S间物种注释准确性的差异（图片引自文献[1]）（图1 左上：不同区域未注释到种水平的比例；左下:不同区域OTU的数目；右图: 进化分支的红色代表不能注释到种水平的比例）
图2 部分和全长16S间“种”水平物种注释的差异（图片引自文献[2]）
2. 无样品和物种偏好性
16S rRNA基因的不同区域的变异在不同物种分类中具有不同的偏好性。因此，不同区域的二代扩增子测序对不同来源和物种组成样本的注释准确性会有偏差。而全长16S扩增子测序由于是对16S rRNA基因的全长序列进行测序，具有更广泛的样品和物种适用性，避免了常规扩增子测序的不同测序区域带来的对不同样品来源和物种的偏好。
图3 部分和全长16S的物种偏好性比较（图片引自文献[2]）
三、应用案例
近年来，全长16S扩增子测序技术在人类健康、农业领域、食品工程、环境工程和极端环境方向均被广泛应用。
1. 肠道菌群
人体和其共生的微生物一起组成了整个庞大而缜密的“个体”，人体细胞是微生物细胞总数的1/10，人类的基因只有微生物基因的1/100。“肠道菌群”是人体的“第二大基因组”。肠道是人体和动物的重要器官，主要负责营养物质的消化和吸收。肠道作为体内最大的淋巴组织，还兼具内分泌及免疫调节的功能。肠道上皮细胞是机体与外环境的屏障，肠道中的微生物（肠道菌群）与肠道的代谢功能与免疫功能密切相关。目前，据不完全统计，利用PacBio 全长16S扩增子技术来研究肠道菌群的物种主要有人、猪、羚羊、斑马鱼、鲑鱼等。
2020年9月发表在《Microbial Biotechnology》上的《Modulation of gut mucosal microbiota as a mechanism of probiotics-based adjunctive therapy for ulcerative colitis》[3]。该研究以分别服用美沙拉嗪+益生菌组（n = 12）和美沙拉嗪+安慰剂组（n = 13）的25名溃疡性结肠炎（UC）患者为研究对象。利用结肠镜检查获得的活检样本进行全长16S扩增子测序，结果表明，服用益生菌的患者炎症症状好转，肠道菌群多样性更丰富，并且有益菌增加。该研究通过利用益生菌的辅助治疗，为缓解UC症状的机制提供了新思路。益生菌可能通过调节肠道粘膜微生物群来缓解UC症状。
图4 治疗对溃疡性结肠炎患者肠道菌群的影响（图片引自文献[3]）
2. 口腔微生物
口腔微生物群落是指定植于人体口腔的微生物集合，当微生物群落与宿主间的生态关系失衡时，可诱发多种口腔感染性疾病，包括龋病、牙周病、智齿冠周炎、牙髓根尖周病颌骨骨髓炎等。甚至口腔微生物群落结构与糖尿病、心血管疾病等疾病紧密相关。口腔微生物群落结构可作为口腔及全身健康的重要标记。研究口腔微生物多样性一般以唾液、痰液等样本为研究对象，目前口腔微生物利用PacBio 全长16S扩增子技术在慢性阻塞性肺疾病、龋齿、牙周炎、牙菌斑等均有文献报道。
2017年11月发表在《Frontiers in Microbiology》上的《Profiling of Oral Microbiota in Early Childhood Caries Using Single-Molecule Real-Time Sequencing》[4]。本研究以21名3-5岁患有严重的早期龋齿儿童和20名年龄匹配无龋儿童作为研究对象。收集唾液样品，利用Pacbio全长16S扩增子测序研究口腔微生物群落差异。结果发现：无龋齿儿童口腔微生物群落结构相对稳定，有龋齿儿童口腔微生物群落结构物种变化较大。乳酸杆菌，普氏菌和韦罗氏菌可能与龋齿的发生机制相关。
图5 无龋齿儿童和早期龋齿儿童口腔微生物物种差异分析（图片引自文献[4]）
3. 土壤微生物
土壤为复杂的生态系统，土壤微生物是土壤的重要组成部分，土壤微生物也是根系微生物的主要来源。土壤微生物在生态环境中起到至关重要的作用，如参与土壤养分循环、分解有机物质、形成土壤团粒结构、传播作物疾病和生物防治、增加土壤养分有效性进而增加植物对养分的利用、缓解逆境土壤对作物生长和生产的压力、加强根系生长以及根部修复等。揭示土壤微生物群落结构、多样性及其时空分布特征对于提高土壤资源利用效率、保障土壤质量和健康以及生态系统可持续发展具有重要的理论和实践意义。
重金属污染是较严重的环境污染问题，它对农作物生产和人类活动产生了不利影响。重金属污染土壤的微生物群落结构和组成也发生了变化。2019年9月，发表在《Microorganisms》上的《Identification of Microbial Profiles in Heavy-Metal-Contaminated Soil from Full-Length 16S rRNA Reads Sequenced by a PacBio System》[5]。本研究基于全长16S扩增子测序技术对韩国重金属土壤微生物群落结构进行研究，结果表明：电导率和重金属是影响微生物群落结构变化的关键因素，嗜盐杆菌和卤化硫杆菌可能在重金属分解代谢中发挥重要作用。该研究还发现了Conexibacter属的序列，这个物种利用二代扩增子测序技术很难鉴定到，该结果同时证实了PacBio全长16s测序技术在物种鉴定方面有更高的分辨率。
图6 污染土壤样品中物种统计（图片引自文献[5]）
4. 水体微生物
水体中富含微生物生长所需的各种营养，是微生物的天然生境。海洋、河流、湖泊、地下水和饮用水中有丰富的微生物。水质的优良、水华的爆发、污染物的降解都与水体中的微生物密切相关，此外，水体中携带的病原菌也是疾病传播的主要因素。
快速砂生物过滤池（RSBF）在去除饮用水中污染物处理系统中被广泛用。生物滤池中的生物膜微生物群落结构在污染物的生物转化中发挥着重要作用。2019年12月发表在《Water Research》上的《Single molecule sequencing reveals response of manganese-oxidizing microbiome to different biofifilter media in drinking water systems》[6]。本研究利用PacBio全长16S扩增子测序技术对磁铁矿砂RSBF（40d、80d、120d，9个样本）和锰砂RSBF（40d、80d、120d，9个样本）中细菌群落进行研究。研究发现，两种模式过滤池中的优势菌群有显著差异。RSBF中的优势物种是锰氧化细菌。锰砂RSBF中细菌相关性更高。两个RSBF反应器的核心细菌组成随着时间的变化趋于一致。
图7 MagSeRSBF和MnSeRSBF中优势物种丰度比较（图片引自文献[6]）
参考文献：
1. Johnson J S , Spakowicz D J , Hong B Y , et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
2. Pootakham Wirulda,Mhuantong Wuttichai,Yoocha Thippawan et al. High resolution profiling of coral-associated bacterial communities using full-length 16S rRNA sequence data from PacBio SMRT sequencing system.[J] .Sci Rep, 2017, 7: 2774.
3. Modulation of gut mucosal microbiota as a mechanism of probiotics‐based adjunctive therapy for ulcerative colitis[J]. Microbial Biotechnology, 2020.
4. Yuan W , Jie Z , Xi C , et al. Profiling of Oral Microbiota in Early Childhood Caries Using Single-Molecule Real-Time Sequencing[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8:2244-.
5. Hur M , Park S J . Identification of Microbial Profiles in Heavy-Metal-Contaminated Soil from Full-Length 16S rRNA Reads Sequenced by a PacBio System[J]. Microorganisms, 2019, 7(9):357-.
6. Zhao X , Liu B , Wang X , et al. Single molecule sequencing reveals response of manganese-oxidizing microbiome to different biofilter media in drinking water systems[J]. Water Research, 2019, 171:115424.
