8+生信，肿瘤分型+实验验证，氨基酸代谢正火！

本文属于单肿瘤分型思路，类似的分型文章我们也解读过很多。

肿瘤分型文章比较重要的结论就是分型后构建的评分能够预测免疫治疗或者其他治疗的疗效。可以用于分型的基因集很多，比如焦亡，坏死性凋亡，铁死亡，自噬，铜死亡，m7G，细胞衰老，各类代谢等等。小编还有一些比较前沿的热点，也是小编出去开会时了解到的，暂时不会公开宣传。

另外还有基于单细胞的分型分析

如果想做类似的分析，欢迎交流。

研究背景：

肝细胞癌(HCC)是一种侵袭性和异质性疾病，具有高发病率和高死亡率的特点。酪氨酸是一种芳香族氨基酸，是所有生物合成蛋白质所必需的，也是分子功能的替代能源。肝脏是参与酪氨酸分解代谢的主要器官。酪氨酸代谢异常可引起包括HCC在内的多种疾病。此外，肿瘤免疫微环境(TME)参与了肿瘤的发生，并影响患者的临床结局。除癌细胞外，TME还包括多种细胞类型，包括内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞、炎症细胞，以及细胞外成分(生长因子、细胞因子、激素等)。然而，酪氨酸代谢模式和免疫分子特征在HCC中的潜在作用尚不清楚。

研究结果：

一、肝癌中酪氨酸代谢相关基因（TRGs）的遗传变异及表达情况

1、在这项研究中,总共包括了42个TRGs。364例HCC患者中,有18.68%(68/364)的TRGs基因突变(图1A)。

2、研究TRGs的体细胞拷贝数变化(CNVs),并发现了42个TRGs的通用拷贝数。其中,DCT,AOX1,ALDH1A3,ALDH3B1,ALDH3B1和BUD23显示了广泛的CNVs放大,而大多数TRGs有CNVs消耗(图1B)。

3、在染色体上对酪氨酸代谢相关基因的CNV改变的位置(图1C)。

4、通过比较HCC肿瘤与正常组织的表达水平，发现TRGs的表达水平与CNV的改变呈正相关。在HCC患者中，具有CNVs增益的TRGs如BUD23和ALDH3B1增加，而在HCC样本中，具有CNVs损失的TRGs减少(图1D)。

二、HCC中酪氨酸代谢亚型的鉴定

1、为了进一步探讨42个酪氨酸代谢相关基因在HCC中的分布和特征，基于42个TRGs的表达，采用共识聚类算法对HCC患者进行分类。为了获得最优聚类数(k值)，计算了一致性系数，发现k = 2是将整个队列排序为聚类a (n = 169)和聚类B (n = 202)的最佳选择(图2A)。

2、主成分分析(PCA)显示HCC患者分布在两个聚类中(图2B)。

3、Kaplan-Meier生存分析显示，聚类A在HCC患者中具有较高的OS (log-rank检验，)、DSS (log-rank检验)和PFI (log-rank检验)，而两个亚型之间的DFI无统计学意义(图2C-F)。

4、比较两个亚组的临床病理特征和酪氨酸代谢相关基因的表达。部分TRGs在A簇中高表达，如MAOB、MAOA、HPD和AOX1，而部分TRGs在B簇中过表达，包括METTL6、BUD23、METTL2B和LCMT1(图3A)。

5、进行了功能富集分析来研究TRGs的生物学行为。GSVA富集分析显示，亚型A在各种物质代谢中显著富集(图3B)。

6、生物过程(BP)表明了RNA代谢过程和核糖核蛋白复合物生物发生的富集功能。细胞成分(CC)显示TRGs主要与核斑点、纺锤体和染色体区域相关。在分子功能(MF)方面，转录协同调节活性、催化活性和钙粘蛋白结合活性主要富集（图3C）。

7、通路分析表明，这些基因在癌症相关通路、各种病毒感染和物质代谢中频繁参与(图3D)。

8、探讨两种亚型之间的遗传变异。在聚类A中，发现195个样本中有171个(87.69%)的突变频率相对较高(图3E)。

9、与聚类A相比，聚类B队列显示出较低的突变频率(161个样本中有134个，83.23%)。不同的是，CTNNB1(44%)是最常突变的基因，其次是TTN(24%)和TP53(17%)(图3F)。

三、不同亚型肿瘤免疫微环境(TME)的特征

1、为了探索TRGs在HCC 中TME的作用，使用ssGSEA方法评估了两种亚型与23种人类免疫细胞亚群之间的关系。

2、观察到两种亚型之间一些免疫细胞的浸润存在显著差异(图4A-B)。

3、研究了两个亚组之间的免疫检查点分布(图4C)。发现大多数免疫检查点在两组之间表达差异，包括CTLA4, LAG3, PDCD1 (PD-1)和CD274 (PD-L1)，这表明酪氨酸代谢相关亚型在免疫治疗中具有潜在作用。

4、使用ESTIMATE R包评估两个亚型之间的TME评分，包括间质评分、ESTIMATE评分和免疫评分。对于TME评分，基质或免疫评分表示TME中基质或免疫细胞的含量，ESTIMATE评分表示TME中免疫或基质评分的聚合。发现A亚型的免疫评分较高，而两亚型间质评分和ESTIMATE评分无统计学差异(图4D)。

四、TRG风险模型的构建与验证

1、为了建立HCC患者的预后预测模型，探索HCC TCGA训练集中的预后基因。采用单因素Cox回归分析，根据每个基因的最优截断值将HCC患者分为高、低危组。

2、对预后相关基因进行LASSO和多变量COX分析，并进行10倍交叉验证以缩小基因范围(图5A, B)。

3、根据风险评分的最佳分界点将HCC患者分为高危组和低危组。Kaplan-Meier分析显示高危组患者OS不良(图5C)， DSS (图5E)， DFI (图5G)和PFI (图5I)。

4、用曲线下面积(AUC)进行了随时间变化的受试者工作特征(ROC)曲线。用曲线下面积(AUC)绘制随时间变化的受试者工作特征(ROC)曲线。OS相关预后亚组1、3、5年生存率的AUC值分别为0.719、0.727、0.722(图5D)。

5、分析DSS 1、3、5年生存率的AUC值(图5F)、DFI(图5H)、PFI(图5J)。

6、接下来，为验证TRGs模型的预后性能，计算了验证集(GSE14520)中的效率。在验证集中获得了相似的结果，表明TRGs的预后模型对HCC患者的预测预后具有极好的预测准确性(图6A-D)。

7、为进一步探索酪氨酸代谢相关特征的预测作用，对HCC TCGA和GSE14520数据集进行了单变量和多变量Cox比例风险回归分析。结果显示，酪氨酸代谢相关特征是HCC患者OS和RFS的独立危险因素(图7A-H)。

五、TRG风险模型中TME和免疫检查点的评估

1、在两组之间进行了GSVA富集分析，发现两种亚型的功能富集不同。高危组核苷酸切除修复、细胞周期、错配修复、剪接体通路富集，而低危组与药物代谢细胞色素p450、补体和凝血级联正相关(图8A)。

2、为进一步探索酪氨酸代谢相关风险模型与TME特征之间的关系，通过ESTIMATE算法研究了HCC的风险亚型和免疫浸润细胞的相关性(图8B-C)。低风险组中活化的CD8 T细胞、CD56自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞和1型T辅助细胞的浸润水平明显升高。

3、计算了高风险组和低风险组的TME评分，结果显示低风险亚型的间质评分和ESTIMATE评分均有所提升(图8D)。

4、研究了两种亚型之间的免疫检查点的概况，发现两组之间的免疫检查点数量有明显的表达，如CD276、CD80、CD86和HAVCR2(图8E)。

六、分析和验证五个TRGs的预后特征

1、进一步分析了HCC患者中5种影响预后的TRGs的表达水平。研究TRGs与其他临床特征(如肿瘤分级、分期、AFP水平、肝硬化和HBV状态)的风险模型，并总结于表1、2。

2、探索了METTL6、GSTZ1、ADH4、ADH1A的表达与肿瘤的分级相关(图9A-E)， METTL6、ADH4、ADH1A的表达也与肿瘤的T分期相关(图9F-J)。

3、评估了TME评分与五个TRGs之间的相关性，发现METTL6和LCMT1与TME评分呈负相关(图9K)。

4、进一步研究了5种TRGs与免疫浸润细胞之间的关系。观察到METTL6和LCMT1与大多数免疫细胞呈负相关，而GSTZ1、ADH4和ADH1A与除活化的CD4 T细胞和CD56自然杀伤细胞外的各种免疫细胞呈正相关(图9L)。

5、探讨了5种TRGs与免疫检查点的相关性。除IDO2和CD160外，METTL6和LCMT1与大量免疫检查点呈正相关，而GSTZ1、ADH4和ADH1A与大量免疫检查点呈负相关(图9M)。

6、研究了5种TRGs与HCC常用化疗药物和靶向治疗药物敏感性的相关性(图9N)。

7、进一步验证研究结果，进行了克隆形成、transwell侵袭实验和免疫组化分析来验证结果。METTL6和LCMT1沉默降低癌细胞迁移，GSTZ1和ADH4缺失增加癌细胞迁移能力(图10A)。

8、未观察到GSTZ1、ADH1A和ADH4在HCC肿瘤与正常组织中的表达有显著差异(图10B)。

9、生存分析显示，METTL6过表达与不良预后相关，而GSTZ1和ADH4高表达则预后良好，这与它们在mRNA水平上的预后作用一致(图10C)。

总结：
在本研究中，揭示了HCC中酪氨酸代谢相关基因和TME特征。本研究的结果证实了HCC中RRGs的遗传和转录变异。揭示了基于42个酪氨酸代谢相关基因表达的两种不同的分子亚型。与B组患者相比，A组患者的生存时间更长。GSVA富集分析显示聚类A在多种物质代谢中均显著富集，如酪氨酸代谢、脂肪酸代谢、组氨酸代谢等，可认为是高代谢。还发现了两个聚类之间的TME特征，其特征是一些激活途径的激活，如癌症相关途径、各种病毒感染和物质代谢。建立了包含5种TRGs (METTL6、LCMT1、GSTZ1、ADH4、ADH1A)的有效预后TRGs风险模型，并验证了其预测能力。来自两种亚型的患者有显著不同的生存结果。多变量Cox回归模型证明，TRGs特征是调整肿瘤大小、结节数量、肝硬化状况和甲胎蛋白(AFP)水平等临床特征的独立危险因素。探讨了TRGs风险模型与TME之间的关系，揭示了METTL6、LCMT1、GSTZ1、ADH4和ADH1A与肿瘤免疫浸润和免疫检查点的强相关性。当前的研究显示了TRGs和免疫微环境的全面分析。据我们所知，这是第一个在HCC中提出无偏倚的酪氨酸代谢相关风险模型的研究。TRGs预后模型可用于HCC患者预后的分类，有助于更好地了解HCC的分子机制，为靶向治疗和免疫治疗提供新的见解。