一文学会单细胞转录组的CellRanger（一）
一、什么是Cell Ranger？
Cell Ranger 是一组分析管道，用于处理 Chromium 单细胞数据，将fastq原始数据经过比对等、生成表达定量矩阵、执行聚类和其他辅助分析等（请参阅示例工作流程和支持的库列表）。Cell Ranger包括五个pipelines ：
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cellranger mkfastq 将 Illumina 序列器生成的demultiplexes raw base call (BCL) 文件解复用为 FASTQ 文件。它是Illumina的bcl2fastq的包装器，可以将一个或多个lane中的混样测序样本按照index标签生成样本对应的fastq文件。此部分一般不需要用户进行，测序公司或者数据库上都会提供拆好的FASTQ 文件。
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细胞计数将获取的FASTQ 文件进行比对(基于STAR)、过滤、条形码计数和 UMI 计数，生成gene-barcode矩阵。此矩阵在filtered_feature_bc_matrix文件夹中，保存为稀疏矩阵。
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Cellranger Multi 用于分析Cell Multiplexing
和Fixed RNA Profiling
数据。它从中获取 FASTQ 文件并执行对齐、过滤、条形码计数和 UMI 计数。它使用 Chromium 细胞条形码生成特征条形码矩阵、确定簇并执行基因表达分析。该管道还支持 Feature Barcode
数据。单纯的单细胞转录组数据一般用不上此功能。 -
Cellranger AGGR整合来不样本的数据，将这些数据标准化为相同的测序深度，然后重新计算特征条形码矩阵并对组合数据进行分析。该管道可用于将来自多个样品的数据合并到实验范围的特征条形码矩阵和分析中。
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Cellranger Reanalyze 采用由 、 或生成的特征条形码矩阵，并使用可调参数设置重新运行降维、聚类和基因表达算法。比如，可以提供Barcode等信息，只重新分析这部分数据。
二、常用的名词概念
- Barcode是10X特有的，由16个随机核苷酸组成，用来区分GEMs，也就是对细胞做了一个标记。可以理解为一个Barcode代表一个细胞。
- UMI就是Unique Molecular Identifier，由4-10个随机核苷酸组成，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA随机连上一个UMI，结果可以计数不同的UMI，最终统计mRNA的数量。
三、Cell Ranger的安装与配置
1、软件下载地址初次使用需要填写信息，类似注册。
标红1，点击可以下载loupe软件，此软件可以打开cellranger结果文件，在window或者mac系统上进行可视化操作，不需要编程基础。
image.png
2、下载方式可使用curl 或wget直接复制代码进行下载
这两个文件是选择一个下载就行，同样文件的不同压缩方式。
image.png
3、系统要求
Cell Ranger 最低要求的 Linux 系统：
8 核英特尔或 AMD 处理器（推荐 16 核）
64GB 内存（推荐 128GB）
1TB 可用磁盘空间
64-bit CentOS/RedHat 7.0 or Ubuntu 14.04 (deprecated November, 2021)
依赖软件：大多软件是和Cell Ranger打包在一起的，解压即可使用，除了mkfastq 需要安装需要Illumina bcl2fastq
4、参考序列下载
同样，复制代码进行下载，官方提供人、小鼠、人和小鼠混合基因组的参考。当然也可以根据需求自行构建参考基因组。
# 去构建需要的基因组
cellranger mkref --genome=GRCh38 \
--fasta=Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa \
--genes=Homo_sapiens.GRCh38.84.filtered.gtf \
--ref-version=1.2.0
image.png
四、运行Cellranger count获得矩阵
我们一般拿到是fastq.gz文件，在软件和参考基因组准备好的情况下，可以直接运行。
#cd 切换到结果文件输出的路径下
$ cd /home/jdoe/runs
$ cellranger count --id=sample345 \ #输出结果的名称
--transcriptome=/opt/refdata-gex-GRCh38-2020-A \ #参考基因组路径
--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \ #fastq数据路径
--sample=mysample \ #fastq数据文件名称的前缀，用于识别
--localcores=16 \ #最多使用16个核
--localmem=64 \ #将限制使用的内存量64G
--nosecondary #只获得表达矩阵，不进行后续的降维、聚类和可视化分析
这里的--fastqs，--id和 --sample需要重点了解。
--id 输出文件名称和结果的名字
--sample 指fastq文件的前缀，可与id不一致
--fastqs 由于fastq文件可以由cellranger mkfastq得到，也可以利用Illumina's bcl2fastq 、公共数据、10X的bamtofastq ,每种情况可能得到的fastq存放位置是不同的，因此，--sample和--fastqs 的设置是不同的，推荐以下方式：
fastq数据存放在一个路径下，不同文件加-1，-2，-3，-4进行区分。注意文件需要按以下格式重命名文件[Sample Name]_S1_L00__001.fastq.gz[Lane Number][Read Type]
比如fastq数据路径下：
image.png
此时只需要设置： --sample=sampleA-1,sampleA-2,sampleA-3,sampleA-4
image.png
五、输出结果
count结果一般放在out目录下，主要有summary和analysis两大类，如果设置了--nosecondary参数则没有analysis的结果。
Outputs:
- Run summary HTML: /opt/sample345/outs/web_summary.html
- Run summary CSV: /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
- BAM: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index: /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
- Unfiltered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix
- Unfiltered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/raw_feature_bc_matrix.h5
- Secondary analysis output CSV: /opt/sample345/outs/analysis
- Per-molecule read information: /opt/sample345/outs/molecule_info.h5
- CRISPR-specific analysis: null
- Loupe Browser file: /opt/sample345/outs/cloupe.cloupe
- Feature Reference: null
- Target Panel File: null
Waiting 6 seconds for UI to do final refresh.
Pipestance completed successfully!
yyyy-mm-dd hh:mm:ss Shutting down.
Saving pipestance info to "tiny/tiny.mri.tgz"
结果的解读内容较多，下期进行讲解，也可阅读官方文档：
Web Summary -Software -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support
