无参转录组分析—使用BUSCO评价转录本拼接的质量

上一节基因课的视频中，我们介绍了使用N50等指标评价转录本的拼接结果。

但是这些指标并不能直接反应拼接结果的质量，比如真实转录本中有多少比例被重构出来？是完整的重构出了整条还是只有部分序列？

要进行这方面的评价，可以使用 BUSCO软件。

BUSCO 的原理很简单，在近缘物种中，总有一些基因是保守的。那么，我们就来看这些保守的基因拼接的完整性和准确性如何。

BUSCO 软件根据OrthoDB 数据库，构建了几个大的进化分支的单拷贝基因集。将转录本拼接结果与该基因集进行比较，根据比对上的比例、完整性，来评价拼接结果的准确性和完整性。

BUSCO 还可以用于评价基因组的拼接、基因集。

基因集可以直接使用 HMMER3 与参考数据库比对；

转录本鉴定出最长读码框架之后，再使用HMMER3 比对；

而基因组需要先使用 Augustus 软件进行基因结构预测，在使用 HMMER3 比对。

1，下载数据库：

BUSCO 目前支持的数据库列表如下，应选择包含当前物种的数据库进行下载。选择不同的数据库，评价结果可能完全不同。根据当前物种，选择下载合适的参考数据库，点击 “Download all datasets”，选择灵长类的数据库下载链接。

mkdir -p ~/database/buscocd ~/database/busco

wget http://busco.ezlab.org/v2/datasets/euarchontoglires_odb9.tar.gz

tar -zxvf eukaryota_odb9.tar.gz

2，使用

需要特别注意的是，输入文件是转录本序列是，每条基因下仅选择一条转录本，否则会被归位‘Duplicate’。

mkdir BUSCO

cd BUSCO

#提取每个基因的最长转录本

perl $TRINITY_HOME/util/misc/get_longest_isoform_seq_per_trinity_gene.pl ../Assembly/trinity_out_dir/Trinity.fasta >longest_isoform.fasta

#运行 BUSCO

busco -i longest_isoform.fasta \

        -l /home/zxd/database/busco/euarchontoglires_odb9 \

        -o busco \

        -m tran \

        --cpu 2

参数说明：

-i|--in: 输入文件

-o|--out: 输出文件、文件夹前缀-l|--lineage: 数据库的路径

-m|--mode: 运行模式，geno|tran|prot

-c|--cpu: 线程数，默认1.

3，结果解读

BUSCO 的结果一看就懂，主要看统计文件run_busco/short_summary_busco.txt 。我们的测试数据数据量太少，下面放一个真实项目的数据。

$ cat run_busco/short_summary_busco.txt 

# 省略若干行

# Summarized benchmarking in BUSCO notation for file longest_isoform.fasta

# BUSCO was run in mode: tran 

 C:89.0%[S:49.9%,D:39.2%],F:4.4%,M:6.5%,n:429 382 Complete BUSCOs (C)

    214    Complete and single-copy BUSCOs (S)

    168    Complete and duplicated BUSCOs (D)

    19    Fragmented BUSCOs (F)

    28    Missing BUSCOs (M)

    429    Total BUSCO groups searched

真实项目中，Complete BUSCOs (C) 的比例通畅都能达到 80% 以上。不过如果低于这个值，也未必有问题，还是要根据实际项目情况判断。除了跟经验值比较。更有意义的是使用不同软件、参数多组装几个版本，挑选最优版。

如果有多个版本，就可以画这样一张图，分析哪个版本更优。

mkdir my_summaries

 #拷贝多个版本的结果到同一个目录中，注意重命名 cp run_SPEC1/short_summary_SPEC1.txt my_summaries/

cp run_SPEC2/short_summary_SPEC2.txt my_summaries/

cp run_SPEC3/short_summary_SPEC3.txt my_summaries/

cp run_SPEC4/short_summary_SPEC4.txt my_summaries/

cp run_SPEC5/short_summary_SPEC5.txt my_summaries/

python BUSCO_plot.py –wd my_summaries

参考：来自基因课笔记，供自己参考笔记，无其他目的。