2021-08-09 iCLIP解析HNRNPC在可变剪接中的调

CLIP-seq （UV cross-linking and immunoprecipitation with high-throughput sequencing）是研究RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）靶标组的重要技术，其基本原理是使用紫外线（UV）将结合在RNA上的RBP与其结合的RNA共价交联，使用核酸酶（例如RNase A，RNase I等）处理交联复合物，将RNA片段化，借助RBP的特异性抗体富集与RBP结合的RNA片段；消化结合在RNA上的RBP后，纯化RBP结合的RNA片段，使用高通量测序技术进行大规模测序，即可以系统鉴定RBP的靶标组。而今天分析的iCLIP（individual-nucleotide resolution UV cross-linking and immunoprecipitation）是在传统CLIP-seq基础上改进相关实验步骤，达到单碱基分辨率水平鉴定RBP结合位点。

iCLIP技术改进点（图1）：（1）在免疫沉淀获取RBP-RNA复合体后，使用蛋白酶K进行RBP的效果，理论上可以实现RNA上全部结合RBP的彻底消化；但实际上与RNA结合的RBP在蛋白酶K消化后会残留部分氨基酸残基，导致在进行逆转录的过程中，cDNA合成在氨基酸残基位置中断。iCLIP则是利用这种特点，根据逆转录中断的位置实现RBP在RNA上的结合位点的高分辨率鉴定。（2）其他的改进点：例如在RNA接头上引入barcode，用于去PCR冗余和更准确的定量分析。

图1 .iCLIP

三言两语

1. 针对HNRNPC的iCLIP发现HNRNPC主要结合在pre-mRNA的intron中，并且存在显著的motif富集：uridine tracts。

2. HNRNPC以四聚体形式结合两组uridine tracts，如果两组uridine tracts均位于同一intron，HNRNPC可以促进邻近exon的可变剪接；如果两组uridine tracts分列在某一exon的两侧intron，HNRNPC则可以抑制该exon的可变剪接（图2）。

图2 .HNRNPC 功能机制

Ref:

Konig, J. et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol 17, 909-915 (2010).