Comparative Molecular Analysis of Gastrointestinal Adenocarcinomas

胃肠道腺癌的比较分子分析

期刊：Cancer Cell；影响因子：26.602

发表单位：麻省理工学院等

导 读

    肿瘤的传统分类利用了起源组织和组织学类型，这些类别已通过针对大量肿瘤的全面分子表征进行了完善。胃肠道腺癌（GIAC）不仅预后不良，而且分子特征也保守，具有类似的内胚层发育起源和暴露于促进肿瘤形成的常见损伤。根据组织来源和分子亚型，超突变的肿瘤表现出多种免疫功能，这对靶向免疫治疗具有重要意义。来自2019年4月发表在《Cancer Cell》上的一项研究中，通过评估区分胃肠道腺癌与其他癌症的基因组和表观差异，讨论了胃肠道腺癌跨解剖学边界的分子特征并提供了对这些恶性肿瘤发病机制的了解。

摘 要

    研究人员分析了921例食道、胃、结肠和直肠腺癌，以检查胃肠道腺癌（GIAC）的共有和区别分子特征。高突变（HM）肿瘤与癌症类型无关，包括那些富含插入/缺失的肿瘤，代表了在CpG岛甲基化表型（CIMP）背景下MLH1表观遗传沉默的微卫星不稳定病例，以及与极突变相关的单核苷酸变异（HM-SNV）升高的肿瘤。具有染色体不稳定性（CIN）的肿瘤具有多样性，胃食管腺癌具有与基因组加倍相关的片段化基因组和明显的突变特征。研究确定了一组结肠和直肠肿瘤，它们缺乏称为基因组稳定（GS）的超突变和非整倍性，并且富含KRAS、SOX9和PCBP1中的DNA超甲基化和突变。

强 调

    胃肠道腺癌包含五种分子亚型：EBV、MSI、HM-SNV、CIN和GS；

    超突变的肿瘤具有不同的免疫特征，并随组织和亚型而异；

    CIN肿瘤在上消化道中显示出更多的片段拷贝数变化；

    基因组稳定的结肠癌亚型中存在SOX9和PCBP1超突变的富集。

研究概要

    数据获取自TCGA 921例原发的、未接受过放化疗的胃肠道腺癌的新鲜冰冻组织（包括79例食道癌、383例胃癌、341例结肠癌和118例直肠癌），其中76例有正常的癌旁组织。数据包括单核苷酸多态性（SNP）阵列、体细胞拷贝数（SCNA）阵列、全外显子组测序、DNA甲基化阵列、mRNA测序、microRNA测序以及部分样本的反相蛋白阵列（RPPA）。

1    GIAC的一般特征

    为了找到区分GIAC于其他来源腺癌（非GIAC）的分子特征，作者首先从突变、拷贝数变异、表达和甲基化水平描述了GIAC的一般特征。与非GIAC相比，GIAC中CpG岛超甲基化频率以及体细胞突变的平均密度更高。所有GIAC中都观察到了频繁的SCNA，尤其是在食道腺癌（EAC）、卵巢和部分非GIAC的乳腺癌中。GIAC中的高频突变基因包括FBXW7、SMAD2、SOX9和PCBP1。染色体13q的臂级扩增是GIAC特有的，此扩增区域中两个转录因子CDX2（13q12.2）和KLF5（13q22.1）可能与GIAC发病机理有关。优先在GIAC中观察到APC和SOX9缺失，以及这些基因中的频繁突变。基因表达分析显示，51个基因在GIAC中的表达显著更高，包括在胃肠干细胞生物学中起作用的几种基因（例如 OLFM4、CD44和KLF4）以及与EGFR信号通路相关的基因。扩增被认为是功能获得（GOF）事件，而缺失、表观遗传沉默以及无义或插入缺失突变被认为是功能丧失（LOF）事件。作者还调查了在GIAC中编码139个对GI发展至关重要的转录因子的基因是否与GIAC中显示出明显的功能丧失事件有关。在至少一种GIAC肿瘤类型中，发现了33个GOF或LOF超过5%的转录因子基因。

图1，胃肠道腺癌的基因组特征。（A）绿色圆圈表示GIAC中的显著突变基因，红色圆圈表示非GIAC中鉴定出的显著突变基因，黄色圆圈表示在所有腺癌中鉴定为显著突变的基因；（B）在GIAC中被鉴定为显著反复扩增（左）或缺失（右）的基因；（C）GIAC和非GI AC中的DNA超甲基化频率（上）、突变密度（中）以及臂级拷贝数事件（下）；（D）不同癌症类型的发育转录因子中GOF或LOF事件的百分比。

2    GIAC中的分子亚型

    确定了胃肠道腺癌具有独特的分子特征后，作者继续探究分子分型。921例样本中有30例为EB病毒高负荷，并且只在胃腺癌中发现，称为EBV+亚型。剩下的891例基于突变密度一分为二，高突变密度组又分为HM-SNV单核苷酸高突变型和MSI微卫星不稳定型，而低突变密度组又分为CIN染色体不稳定型和GS基因组稳定型。分子分型与GIAC的关键免疫特征相关，EBV+和MSI肿瘤表现出较大的IFNγ特征，HM-SNV中发现HLA/抗原呈递的减弱和NK细胞基因表达的显著升高。使用癌症相关的甲基化位点对GIAC的DNA甲基化数据进行聚类，显示EBV+胃癌中广泛的CpG岛甲基化。超突变的肿瘤主要位于胃肠道的中部、胃远端和结肠近端，而CIN肿瘤在解剖学上的极端、食道和结肠/直肠远端更普遍。高CIMP遍及整个上消化道和近端结肠，导致MSI的MLH1表观遗传沉默主要发生在远端胃和结肠近端。

图2，胃肠道腺癌的分子亚型。（A）鉴定分子亚型的流程图；（B）GIAC的SNV密度、插入缺失密度和克隆缺失评分（CDS）；（C）IFNγ通路评分（上）和CD8+T细胞评分（下）；（D）GIAC的DNA甲基化的无监督分析；（E、F）跨解剖区域的亚型（E）和CIMP亚组（F）分布；（G、H）高CIMP肿瘤中MLH1/CDKN2A沉默（G）和亚型（H）在解剖部位的分布。

3    超甲基化和超突变分析

    MSI肿瘤的特征和组织来源无关，提示这类肿瘤具有共同的生物学特征。考虑到大多数MSI病例在高CIMP的背景下都是由于启动子DNA高甲基化导致MLH1的表观沉默，作者探究了不同CIMP亚型的基因突变景观：高CIMP亚型仅在结肠中与BRAFV600E突变相关，低CIMP亚型富含KRAS突变；高CIMP亚型普遍存在肿瘤抑制基因CDKN2A的甲基化，TFAP2E启动子甲基化存在于大部分高CIMP亚型中。一部分同时缺乏MLH1甲基化和CIMP表型的MSI病例在MLH1或MSH2中包含体细胞突变，这表明DNA错配修复丧失的途径。与非高CIMP MSI病例相比，高CIMP MSI显示APC或CTNNB1突变的组合频率以及WNT基因表达降低。所有亚组中的表观遗传沉默基因的途径分析表明，编码DNA结合蛋白和转录因子的基因富集。

图3，MSI和CIMP肿瘤分析。（A）具有四种CIMP的甲基化亚型，并指示了基因改变；（B）带有MLH1沉默、KRAS、BRAF、MLH1和MSH2突变的高CIMP和MSI肿瘤的甲基化谱；（C）消化道和高CIMP状态分层的MSI肿瘤特征；（D）不同肿瘤中独特或重叠的表观遗传沉默基因；（E）上GI MSI与下GI MSI肿瘤中基因的沉默频率（黑色）和突变（蓝色）。

4    CIN亚型的分子特征

    尽管结肠癌基因组的受影响区域总体上相似，但SCNA的格局显示胃食管腺癌比结肠癌相具有更精细的片段化基因组。上GI和下GI的局部扩增差异大于缺失的差异，特别是高水平局灶性扩增。与CIN-B胃食管腺癌相比，CIN-F胃食管腺癌的全基因组重复（WGD）明显更多，对编码RTK、KRAS和细胞周期介体的基因的扩增显著更频繁，以及更高的TP53突变频率和癌基因扩增率。CIN-F胃食管腺癌与晚期肿瘤相关，强调了其潜在的临床意义。与CIN-F结肠癌相比，CIN-B结肠癌中PIK3CA突变和TGFβ途径改变更普遍。在CIN-B胃食管腺癌组中，癌基因通过突变而不是通过扩增被激活，早期APC丢失和选择致癌基因（如KRAS）的突变激活的优势可能先于非整倍体和转化的形式出现。

图4，上消化道CIN亚型的分子特征。（A）非超突变GIAC的拷贝数热图；（B）上胃肠道和下胃肠道在CIN肿瘤中的臂水平和病灶拷贝数事件的图；（C）胃肠道CIN肿瘤的CIN-F（CIN-Focal）评分分布；（D）消化道临床分期的CIN-F评分分布；（E）上消化道CIN-F和CIN-B肿瘤的全基因组加倍事件；（F）RAS、细胞周期和肿瘤抑制基因、TGF调节因子、TP53在上消化道CIN-F和CIN-B肿瘤中的改变频率；（G）上消化道CIN-F和CIN-B发病机制的示意图。

5    GS亚型的分子特征

    CIMP+CIN CRC结肠癌中体细胞突变的频率明显较高，特别影响TGFβ途径的关键癌基因，表明CIMP状态可能在塑造下消化道CIN肿瘤的发展中起重要作用，而在上消化道的CIN肿瘤的形成中起较小的作用。尽管结肠癌通常在超突变/MSI和CIN之间进行划分，但作者检测到既缺乏非整倍性/CIN又缺乏超突变的结肠癌人群，将该组归为GS。突变分析显示，13％的GS结肠癌的PCBP1的KH域中存在高度聚集的错义突变，增加了发生GOF事件的可能性。GS结肠癌与CIN结肠癌的比较显示，非CIMP CIN结肠癌，高CIMP或低CIMP CIN结肠癌与GS结肠癌之间的特征逐渐分级，表明了包含低CIMP表型的APC突变细胞能够通过维持其他致病性突变而进行转化，而无需p53丢失或非整倍性。此外，作者还讨论了APC突变引起的高CIMP表观遗传畸变引发的另一种结肠癌途径。

图5，CIN和GS大肠癌的分子特征。（A）非CIMP CIN、高CIMP/L CIN和GS下消化道肿瘤中指定基因或途径的体细胞改变频率；（B）下胃肠道亚型之间的SCNA（上）、突变密度（中）和CIMP类（下）；（C）较低GI GS中SOX9和PCBP1中体细胞突变的分布；（D）下胃肠道分子亚型的发病机理示意图；（E）在较低的GI CIN/GS解剖结构上分层的指示基因突变的频率。

6    GIAC中的突变标记

    由于MSI和低GI HM-SNV组中MSI和POLE缺陷型肿瘤的高突变负担，在GIAC中，MSI和POLE标记是主要的特征得分。去除超突变病例后的标记发现BRCA标记、两个APOBEC标记、类似于COSMIC标记17的标记和常见的AA>AC转换，以及在CpG二核苷酸处以C>T转换为主的标记。APOBEC标记存在于整个GIAC中，但其他3个标记在非高变GIAC中具有实质性的活动，AA>AC标记仅限于上GIAC。BRCA标志活性与上消化道癌（尤其是CIN亚型）之间存在显著相关性，AA>AC标记富集于CIN-F和TP53突变的上GI CIN肿瘤中。CpG>TpG模式，通常称为衰老标记，在右侧结肠癌中尤为常见。CIMP状态与CpG>TpG标记之间的关联可能反映了CIMP肿瘤需要更多的细胞分裂才能进展，因此随着时间的推移会获得更多的CpG>TpG突变。

图6，胃肠道腺癌突变特征。（A）在非超突变GIAC中的突变特征通过替换类别和紧接突变碱基的3'和5'序列显示；（B）通过解剖分布GIAC的关键分子特征；（C）上、下胃肠道在CIN和GS亚型中突变特征的强度；（D）上、下胃肠道的CIN和GS肿瘤中的BRCA标志；（E）在上GI CIN肿瘤中由CIN-F和CIN-B分层的AA>AC标记（上）和TP53突变（下）；（F）根据CIMP状态分层，上、下GI的CIN和GS肿瘤中的CpG> TpG特征。

讨 论

    本研究分析了921例胃肠道腺癌，鉴定了其区别于其他癌症的分子特征。将GIACS分为5种分子亚型，发现高突变肿瘤具有不同的免疫特征，取决于组织来源和分子亚型。而低突变密度组，染色体不稳定的上消化道腺癌表现出更多片段化的拷贝数变异，伴有基因组加倍和明显的突变特征，基因组稳定的结直肠腺癌富集SOX9和PCBP1基因突变。结果强调了DNA超甲基化和CIN等过程如何在相关组织中以不同的方式表现出来，在分子缺陷的各种表现形式中提供更详细的信息可能揭示针对这些癌症的靶向疗法的新机会。