回顾illumina 双端测序原理
回顾二代双端测序原理
双端测序
上样
flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，测序就在此进行。lane上随机分布两种接头，p5‘（与P5互补），P7（与P7'互补），待测序列自带了p5接头和p7接头。序列只能一开始是利用p5接头互补，因为p7接头和lane是一样的。将构建好文库中的待测序列配置成一定的浓度通过flowcell，序列会在特异的化学试剂作用下，强力随机地附着在lane上，并与上面的短序列配对。上样的结果就是lane吸附住了冲过来的DNA，并且可以在表面进行桥式PCR扩增。要测序的是模版链p5 - p7，开始它与lane接头配对产生了互补链，后来强碱试剂作用下去杂，两条链被分开，由于模版链没有附着在lane上，模版链被冲走，但是互补链p5‘- p7‘ 依然稳稳固定在lane上。加入缓冲溶液，互补链的p7‘和lane上的p7互补（但还是一个lane中的），目的是快速扩增lane p7接头连接的链，也就是正链Forward Strand，它和模版链是一致的，后来测序的只用这一部分。PCR弯成桥状，一轮桥式扩增一倍，大约35个循环后，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，这PCR是一群完全相同的序列，叫做cluster。桥式PCR目的在于实现放大单一碱基的信号强度，满足后期测序需求。桥式PCR完成后，形成了很多的桥形的互补双链，再次强碱解链。这一次不再进行复制，而是利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）选择性的切掉lane 上p5‘ 连接的链，只留下了与lane p7连接的链即Forward Strand。
测序
首先primer结合到靠近p5的sequencing primer binding site1上，再加入特殊的dNTP--它的3‘ 羟基被叠氮基团替代，因此每次只能添加一个dNTP；还含有荧光基团，能够激发出不同颜色；在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉；再加入激发荧光缓冲液，用激光激发荧光信号，光学设备记录荧光信号的记录，计算机将光学信号转化为测序碱基。
当信号被记录后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并使dNTP 3’ 叠氮基团变成羟基，这样能继续向下进行再加一个，并且保证这个不再发出荧光。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，得到了Forward Strand序列。
循环结束后，read product被冲掉，index1 primer和链上的index1 互补配对，进行index1的检测。测完后，洗脱产物，得到index1 的序列。接下来p5与lane上的p5‘配对，测得了index2，并洗脱。
洗脱掉index2 产物后，还是一轮桥式扩增，得到双链，再变性得到原始Forward strand 和 新的Reverse Strand， 除去测完的Forward strand。然后和测Forward一样，也是先连接primer，只是连接的位点是Primer Binding Site2，测完后得到reverse strand序列。
细节阐述
Flowcell（流动池）是有着2个或8个lane（泳道）的玻璃板，每个lane可以测一个样本或者多样本的混合物，且随机布满了能够与文库两端接头分别互补配对或一致的寡核苷酸（oligos，P7和P5接头）。一个lane包含两列，每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）。
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一、Library Preparation文库的构建
1. 利用转座子（transposome）对双链DNA进行剪切以及接头（adapter）的连接
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2. 接头连接成功后，利用低循环扩增技术在接头处进行修饰，分别在两端添加sequencing primer binding site1 / sequencing primer binding site2（即测序引物结合位点）、index1/index2以及我们称之P5和P7的寡核苷酸序列
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注意：
- P5和P7是不同的，它们分别和flowcell上的接头互补和相同。为了方便阐述，将与P5互补的接头称为P5’，与P7互补的接头称为P7’。
- index1和index2也是不同的，与P5相连的是index2，与P7相连的是index1
关于index，也叫barcodes，因为一个lane可以同时测多个样品，为了避免混淆样品的read products，每种样品的DNA由一种index修饰，这样测序得到的reads都是具有index标记的，在测序结果中，依据之前标签与样品的对应关系，就可以获得对应样品的数据。而这里的index1和index2是为了区分paired-end测序得到的双端reads。
二、Cluster generation 簇生成
1. Flowcell上随机分布了两种不同的寡核苷酸序列，分别与P5互补（即P5’），与P7一致（即P7）。
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2. 待测sequence通过P5与folwcell上的P5’序列杂交互补，以待测sequence为模板进行互补链（即reverse strand）的延伸，互补链的两端为P5’和P7’。
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- 接下来模板链被切断并洗下
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Reverse strand的P7’与Flowcell上的P7杂交互补，进行链的合成，这就是我们所熟知的桥式PCR
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接下来合成的双链被解链，再分别与Flowcell上的接头杂交互补，延伸，解链，杂交，延伸，解链...如此重复35个循环
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4. 桥式PCR完成后，使用NAOH将双链解链，并利用甲酰胺基嘧啶糖苷酶（Fpg）对8-氧鸟嘌呤糖苷（8-oxo-G）的选择性切断作用，选择性地将P5’与链的连接切断，留下与Flowcell上P7连接的链，也就是Forward strand。同时游离的3’端被阻断，防止不必要的DNA延伸
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三、测序
1. 测序引物（sequencing primer）结合到靠近P5的测序引物结合位点1（sequencing primer binding site 1）上，在系统中加入四种dNTP和DNA聚合酶。这里的dNTP有两个特点：它是有荧光基团标记的，每种碱基标记的荧光基团不一样；它的3’末端连了一个叠氮基，这个叠氮基能够阻断后面的碱基与它相连
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因此在聚合酶的作用下，与Forward strand相应位置碱基配对的dNTP就会结合到新合成的链上，而由于叠氮基的存在，后面的dNTP无法继续连接。这时用水将剩余的dNTP和酶给冲掉，将Flowcell进行扫描，扫描出来的荧光对应的碱基的配对碱基即是该链该位置的碱基。同时在这个Flowcell上有成千上万个cluster也在进行同样的反应，因此一个循环就能同时检测多个样本（这也是高通量的核心所在）。这个循环完成后，加入化学试剂把叠氮基和标记的荧光基团切掉，进行下一个循环（碱基的连接、检测与切除）。如此重复直至所有链的碱基序列被检测出，也就是Forward read 序列。
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2. Index测序：所有循环结束后，read products 被洗掉，index1 primer与链上index primer1 结合位点杂交配对，进行index1的合成及检测
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3. Index1测序完成后，洗脱测序产物。此时机器已通过荧光得到了index1的序列
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4.Index2测序：Forward strand顶端的P5序列与Flowcell上的P5’杂交配对，进行index2测序。测序完成后洗脱产物
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四、Paried-end sequencing（即对Reverse strand测序）
1. 洗脱index2测序产物后，以Flowcell上的P5’为引物，Forward strand为模板进行桥式扩增，得到双链
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2. NAOH使双链变性为单链，并洗去已经测序完成的Forward strand
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- 类似的，readprimer2结合到靠近P7’的read primer binding site 2开始对Reverse strand的测序。测序完成后即可得到Reverse read序列。
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前面介绍的都是paired-end的测序，而single-end测序方式是只将index，sequencing primer binding site以及P7/P5添加到 fragamented DNA片段的一端，另一端直接连上P5/P7，将片段固定在Flowcell上桥式PCR生成DNA簇，然后单端测序读取序列
