Biostar_handbook||charpter 12. B

BLAST: basic local alignment search tool。包括：blastn, blastp, blastx, tblastn, tblastx

BLAST 基本步骤

1. 准备数据库：makeblastdb
2. 选择blast工具：包括blastn, blastp等
3. 运行得到结果，对输出进行修饰

Blast工具类型：

Blast 术语 terminology

• Query: 检索的序列
• Target：需要比对的数据集合，数据库。
• Subject：how we refer to an entry that matches.
• Score：比对的得分
• E-value：期望值阈值。1.E值适合与有一定长度，且复杂度不能太低的序列。2. 当E值小于10-5时，表明序列有较高的同源性，而非因计算错误。3.当e值小于10-6表明两序列的同源性非常高，几乎没有必要再做确认。

建库

以水稻cds数据为例，搜索拟南芥REV的同源基因

### 下载水稻cds和pep数据
wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-39/fasta/oryza_sativa/cds/Oryza_sativa.IRGSP-1.0.cds.all.fa.gz
ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-39/fasta/oryza_sativa/pep/Oryza_sativa.IRGSP-1.0.pep.all.fa.gz
gunzip *.gz

### 建库
makeblastdb -in Oryza_sativa.IRGSP-1.0.cds.all.fa -dbtype nucl -out oriza.cds.fa
makeblastdb -in Oryza_sativa.IRGSP-1.0.pep.all.fa -dbtype prot -out oriza.pep.fa

### bio_handbook示例
esearch -db protein -query PRJNA257197|efetch -format=fasta >index/all-protein.fa 
makeblastdb -in all-protein.fa -dbtype nucl -parse_seqids
blastdbcmd -db all-protein.fa -entry 'all' -outfmt '%a' |les

检索比对

BLAST 常用命令：

• task命令： 指不同的检索算法，目的为适应某些特殊的序列（短序列等）其中blastn包括以下task：
  • blastn:更为宽松的检索，find more divergent sequences
  • megablast:较为严格的检索，此为blastn的默认检索算法，find less divergent sequences
  • blastn-short:对短序列进行的检索
• db：数据库位置
• query：检索的文件
• out：输出的文件
• evalue：期望值阈值1e-5
• perc_identity：根据相似度对输出结果过滤
• remote：远程NCBI的数据库 ，需-db nr
• query_loc：检索的位置
• outfmt：输出的数据格式，常用的为6，7
  • qaccver: 检索序列的ac号
  • saccver: 目标序列的ac号
  • pident:完全匹配百分比
  • length:联配的长度
  • mismatch:错配数目
  • gapopen:gap的数目
  • qstart:检索序列的起始
  • sstart:目标序列起始
  • send:目标序列起始
  • evalue:期望值
  • bitscore:BIT得分
  • score:原始得分

### 检索
blastn -db oriza.cds.fa -query ath_REV.fa -outfmt 7 ###无检索结果

blastn -task blastn -db oriza.cds.fa -query ath_REV.fa -outfmt 7 ###较为宽松，结果很多。


### 指定输出格式 pident 为identity值
blastn -task blastn -db oriza.cds.fa -query ath_REV.fa -outfmt "6 qseqid sseqid pident" 

## 书中按照identity值进行排序
blastn -task blastn -db oriza.cds.fa -query ath_REV.fa -outfmt "6 qseqid sseqid pident" | sort -k3 -rn |head 5

• 对于低复杂度的序列(low complexity，重复序列较多)，加上参数-dust no
• 序列联配，两两比对加参数-subject

efectch -id NC_001133 -db nucleotide -format fasta > NC_001133.fa

blastn -query start.fa -subject NC_001133.fa

其它的一些BLAST-like的程序

• Diamond快速blast
• RAPSearch2：A memory-efficient implementation of RAPSearch algorithm for protein similarity search with a large database and a large queryset.

一些diamond命令

###建库
diamond makedb --in nr.faa -d nr

##比对
diamond blastp -d nr -q reads.fa -o align.txt -f 6

快速是会以准确性为代价的，尚不知道diamond的准确度有多好？