无缝克隆技术
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每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过 N 次的 PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？
今天就给大家详解可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标 DNA 的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
传统克隆与无缝克隆的区别
图片来源：汉恒
传统克隆
• PCR 引物设计需引入载体上的酶切位点，PCR 产物再经过酶切、胶回收、连接后定向克隆到目的载体上；
• 需要查找合适的酶切位点，购买各种内切酶；
• 阳性率低；
• 多个片段，通常只能分多次拼接。
无缝克隆
• 只需要一次反应即可完成定向克隆，省略酶切、酶连等过程；
• 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；
• 连接片段之间不会引入任何其他序列；
• 可以同时克隆多个片段。
无缝克隆的优势
相较于传统克隆的方式，有几点显而易见的优势：
1. 可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；
2. 可同时连接多个 DNA 片段，最多可达 10 个；
3. 不附加任何多余序列，精确定向连接；
4. 体系反应时间仅需 20 min，快速反应。
那无缝克隆到底应该怎么做呢？
首先我们就来详细了解下无缝克隆其原理：
在基因克隆的引物设计及目的 DNA 片段的扩增阶段，与常规 PCR 法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有 15～20 个同源碱基，由此得到的 PCR 产物两端便分别带上了 15～20 个与载体序列同源性的碱基。
图 1：无缝克隆原理图
在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下 3 点：
第一步： 线性化目的载体（图 1 左上）：用酶切或是 PCR 方式
1. 质粒酶切法
在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
2. 质粒 PCR 法
如果没有合适的酶切位点，你也可以通过 PCR 方法实现载体的线性化。
图 2：PCR 法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段
第二步：PCR 获取目的片段。设计的引物５’端需要和线性化载体末端有 15~25bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段）；
图 3：目的片段同源的引物设计
针对双酶切法线性化载体设计插入片段的 PCR 引物，其重叠区域为 15~25 bp + 酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是 PCR 法线性化载体，扩增插入片段的 PCR 引物 5’端直接设计成与线性化载体末端 15~25 bp 重叠即可。
第三步：按照一定比例把二者混合在 HB-infusion™（无缝克隆试剂盒）的 2× 预混液内，50℃反应 20min 后直接转化 E.coli 即可。
反应体系如下：
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通过以上三步，就可以完成质粒重组。只要再进行后续的转化感受态等操作，就可以完成载体构建。
当然，这么简单高效的分子克隆方式， 怎么能少了汉恒生物的 HB-infusion™ 无缝克隆试剂盒呢！
无论你是要做简单的克隆，还是多片段克隆或者突变体克隆，包括载体改造和 crispr 载体构建等都可以用到汉恒生物的无缝克隆试剂盒。
第二篇
克隆是一件很酷的事情。利用限制性内切酶来处理载体和片段，可以使它们成为两块契合的拼图，然后“啪”地一声拼在一起，就成为理想中的重组载体。这种经典操作已经流行了几十年，为人们所熟知。不过，如果你需要克隆多个片段，或者引入突变，你会觉得这一点也不酷。传统克隆有着一定的限制，操作也相当的繁琐。
然而，在Clontech（现在的Takara Bio USA）推出In-Fusion克隆技术后，你才发现，原来克隆还可以更酷。这个设计巧妙的产品操作简单方便，不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作，在15分钟内，能将任何PCR产物片段定向克隆到任何载体上。真正一步解决PCR克隆上的所有技术烦恼。
In-Fusion的原理
In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端的15 bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。你只需将目的片段和线性化载体与预混合酶试剂相混合，在50℃孵育15分钟就行了。
对研究人员来说，最幸福的地方就在于可以使用任何自备的载体。你只需选择适当的表达载体，选择最佳的酶切位点，单酶切或双酶切后得到线性化载体即可。即使没有合适的酶切位点，你也可以通过PCR方法实现载体的线性化。这样，你就不需要重复的亚克隆，也不需要T载体那样的中间载体。
此外，你也不用担心克隆留下的“小疤痕”了。In-Fusion克隆不附加任何多余序列，可实现完美的无缝克隆，对构建表达载体来说是再理想不过了。由于PCR产物两端的序列不同，这种类似同源重组的反应是精确定向的，不需要检验插入片段的方向，也为你节省了不少时间和精力。
In-Fusion的应用
多片段克隆
对于传统的克隆技术，你每一轮只能克隆一个插入片段。随着实验变得越来越复杂，克隆需要进行许多轮，这样难度系数一下子提高了。不过对In-Fusion无缝克隆来说，多片段克隆仍然是小菜一碟。只要In-Fusion引物设计好，多片段的克隆只需单次反应就能完成。
突变生成
利用In-Fusion技术，你还可以实现定点突变，包括缺失、添加或者替换。你可以设计包含突变位点的引物，并按照操作手册进行实验，轻松获得突变体。
高通量克隆
In-Fusion克隆技术因其简单灵活、结果可靠，也被广泛应用于大规模的高通量克隆。Oxford Protein Production Facility（OPPF）已采用In-Fusion 克隆系统构建了pOPIN vector 重组载体库 。OPPF科学家以703个PCR片段为目的片段成功构建了661重组载体，总体克隆效率可达到94%。文章已发表在Nucleic Acids Research上。
