每周文献 2022-03-27
大家好，本周给大家分享的是最近发表在NC上与沙羊草茎锈病抗性基因Sr62相关的一篇文章。
文章题目：Aegilops sharonensis genome-assisted identification of stem rust resistance gene Sr62 (基因组辅助鉴定沙羊草茎锈病抗性基因Sr62)
期刊：Nature communications
影响因子： 2020_IF = 14.919; 中科大类: 综合性期刊1区; 中科小类: 综合性期刊1区; JCR分区: Q1
发文单位：英国John Innes中心、沙特阿拉伯阿卜杜拉国王理工大学等15家单位。
文章作者：英国John Innes中心Guotai Yu为第一作者，Brande B. H. Wulff为通讯作者。
摘要：小麦的野生近缘和祖先种已被广泛用作抗病基因的来源。这些R基因的分子鉴定和表征有助于它们在育种计划中的应用。本研究构建了野生二倍体小麦近缘种沙羊草(Aegilops sharonensis)的参考质基因组，利用定位、诱变、RNA-Seq和转基因技术，鉴定了已转入普通小麦的茎锈抗性基因Sr62。该基因编码一个串联激酶，其同源基因存在于植物界中的多个类群中。稳定的Sr62转基因小麦对茎秆锈病的不同菌株表现出高水平的抗性，突出了Sr62的用途，最大限度地提高茎秆锈病抗性的耐久性。
主要结果：
1、Sr62的定位
小麦Zahir品种之前已将抗茎锈病性转移到沙羊草染色体1Ssh和密切相关的小麦染色体1BL/1DL之间的补偿罗伯逊易位中（图1a）。为了对Sr62进行精细定位，作者通过来自植物803的F4:5和F5:6植株的自交以及1号染色体上Sr62间隔的杂合子，为Sr62构建了一个大群体分离。作者用Sr62两侧的标记对该群体的4638株植物进行了基因分型，发现C11308_KASP和C67147_KASP之间有12个重组子（图1b）。通过在该区间产生更多标记并对12个重组子进行表型分型，将Sr62定位到标记S741_KASP-7和C03246_CAPS之间的区域，对应于沙羊草1号染色体短臂上480kb的区域内（图1c）。对AS_1644进行了RNA测序，并将读取结果映射到组装基因组。鉴定了7个转录基因，它们与编码remorin家族蛋白、一个壁相关激酶（WAK）、两个小麦串联蛋白激酶（命名为WTK5和WTK）、一个NLR、一个50S核糖体蛋白（50S-RP）和一个Eat1-B1蛋白靶标（TOE1-B1）的基因同源（图1d）。
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图1. Sr62在染色体1Ssh上被定位到480 kb的区域内。a、小麦-沙羊草易位染色体和沙羊草染色体1Ssh。b、沙羊草染色体1Ssh短臂上Sr62区域的遗传图谱。c、Sr62附近区域的物理图谱。d、候选区间中界定了Sr62的存在。
2、鉴定Sr62候选基因以及Sr62使转基因小麦具有茎秆锈病抗
为了在定位区间的候选基因中鉴定Sr62，作者对Zahir-1644小麦-沙羊草渐渗系进行了EMS诱变。将突变RNA的reads与这七个基因的转录本对应起来，称之为MutRNA-Seq（图2），这一过程在14个突变体中的7个中确定了WTK5的8个点突变。作者预测了WTK5的开放阅读框架，发现其中七个突变引入了非同义突变，而一个突变引入了早期终止密码子（图3a，b）。作者绘制了Sr62相对于两个蛋白激酶结构域的突变图谱，发现七个氨基酸替换均匀分布在整个预测的氨基酸序列中，激酶1结构域有三个突变，激酶2有两个突变（图3b）。将两个PCR产物分别克隆并通过三向连接组合成二元载体：得到的重组WTK5跨越11.9kb（图3c）。作者获得了三个独立的初代转基因株系（T0）。所有三个株系都对Pgt茎锈菌小种TTKSK（来自肯尼亚的04KEN156/04分离物）、TKTTF（来自埃塞俄比亚的13-ETH18-1分离物）、TKTTF（来自英国的UK-01分离物）和QTHJC（来自美国的69MN399分离物）产生了抗性（图3d）。
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图2. 通过突变和转录组测序（MutRNA-Seq）鉴定候选基因。
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图3. EMS诱变及小麦转化Sr62的功能验证。a、Sr62的结构，预测由EMS衍生的功能缺失突变引起的核苷酸变化。b、Sr62蛋白的示意图，显示了两个蛋白激酶结构域的位置以及由EMS突变引起的预测氨基酸变化。c、小麦品种Fielder用于转化Sr62序列。d、3个纯合独立转基因株系与4个Pgt分离株系的反应。
3、牧草中Sr62与其他串联激酶的序列关系
为了探索Sr62与主要谷物作物物种和野生禾本科植物中的其他串联激酶之间的关系，作者对六倍体小麦（Triticum aestivum）、硬粒小麦（Triticum durum）、大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）和野生小麦亲缘Ae. tauschii和Ae. sharonensis中的串联激酶进行了系统发育分析（图4a）。抗性基因Sr62、Pm24、Rpg1、WTK4和Yr15属于聚类最多的分支，而Sr60位于一个小而独立但密切相关的分支中（图4a）。接下来，作者从每个串联激酶中分离出两个蛋白激酶结构域，构建了一个系统发育树。在树中，Rpg1和WTK4的两个域在分支4中彼此相邻（图4b）。
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图4、谷类作物与野生牧草串联激酶的系统发育树。a、基于串联激酶编码序列的系统发育。b、基于单个蛋白激酶域编码序列的系统发育。
4、Sr62附近的共线性是密切相关的牧草特有的
作者对Ae. sharonensis Sr62两侧的10个基因进行了共线性分析，并在跨越6000万年进化的9个禾本科基因组中对该区域进行了比较。共线区包含一个F-box蛋白、一个谷氨酰-tRNA还原酶、一个含有五肽重复序列的蛋白、一个remorin家族蛋白、一个蛋白激酶、一个NLR和一个TOE1-B1（图5）。小麦和山羊草种内的共线性保持良好，大麦的共线性程度较低，大麦与小麦和山羊草相比经历了广泛的重排。然而，短柄草、水稻、高粱和玉米中似乎没有这个区块，这表明它出现在1160万到3500万年前（图5）。
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图5、Sr62周围共线性。基因组区域包含与Sr62同源的基因和周围的基因显示微共线。
总之该研究鉴定了沙羊草茎锈抗性基因Sr62。该基因编码一个串联激酶，稳定的Sr62转基因小麦对茎秆锈病表现出高水平的抗性，加深了人们对小麦抗病机制的理解。
文中所有图片均来自Reduced reproductive success is associated with selective constraint on human genes
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文章链接地址：https://www.nature.com/articles/s41467-022-29132-8
参考文献：
Yu, G., Matny, O., Champouret, N. et al. Aegilops sharonensis genome-assisted identification of stem rust resistance gene Sr62. Nat Commun 13, 1607 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29132-8
