研究思路 | 单细胞多组学如何研究？不要看别的了，一文让你懂的透
上期，跟大家分享了研究思路 | 单细胞多组学如何研究？不要看别的了，一文让你懂的透透的（上） - 简书 (jianshu.com)，通过单细胞多组学联合研究可以实现更准确的细胞鉴定，将基因表达与染色质可及性的分析结果相互印证，鉴定细胞类型特异性的顺式基因调控元件及转录因子（TFs），并初步探究细胞类型特异性的转录调节机制等。通过以上研究内容，足以揭示与肿瘤、疾病相关的基因调控网络及其背后的分子机制。
那么，单细胞多组学联合研究的思路就到此为止了吗？非也！更加深入的探究其转录调控发生机制，才是高分文章的“制胜法宝”。 接下来给大家带来单细胞多组学的联合研究的Plus版研究内容。
一、深入探究转录调控的动态发生机制
转录因子会发生顺序级联重塑，不同细胞类型也会呈现出染色质可及性的动态变化。如果把发育分化或疾病发生发展作为一个时间线，那么单细胞多组学的数据就可以体现出基因表达、染色质开放性和TF调控模块等不同因素随“时间”变化而产生的动态变化，进而深入探究DNA结合因子和顺式调控元件之间的分子互作如何动态调控基因的表达程序以及如何决策细胞的发展命运。
1.揭示发育过程中连续的转录因子表达及其Motif活性的动态变化
2021年Cell针对人大脑皮层的多组学研究中[1]，为将表达轨迹与调控元件的可及性动力学联系起来，将拟时间值从RNA数据转移到ATAC数据，结果在染色质数据中产生了一个平滑的拟时间连续结果，鉴定了顺式调控元件-基因（CRE-Gene）对，发现拟时间早期活跃的连锁基因富集在细胞分裂和神经前体增殖等通路，后期活跃的连锁基因与形态发生、迁移和成熟有关。为了解可能控制这上述程序的TFs，作者还鉴定了神经元发育的早中晚期各自富集的转录因子Motif。因此，通过将特定的TFs进行拟时间上的聚类分析，能够发现动态调节因子的TFs表达及其Motif活性随发育时间的变化。
图1 皮层神经元分化过程中基因调控的连续轨迹（图片引自文献[1]）
2.解析细胞类型异常变化的转录因子的潜在调控机制
2021年Nature Genetics针对阿尔兹海默病（AD）的多组学研究中[2]，构建了疾病相关胶质细胞的发育轨迹。为阐明与晚期AD相关的少突胶质细胞的功能状态，检测相关基因的表达信号，进而通过拟时间轨迹分析重现了少突胶质细胞的成熟过程。分析发现，大量的染色质重塑和转录重编程可能是少突胶质细胞成熟的基础。值得注意的是，少突胶质细胞发育过程中的两个关键TFs——核呼吸因子1（NRF1）和固醇调节元件结合因子1（SREBF1），分别在少突胶质细胞发育的过程中充当转录抑制因子和转录激活因子。因此，在探究连续的基因表达、染色质可及性发育轨迹的过程中鉴定发挥抑制或激活作用的关键TFs，能够为解析细胞类型的异常变化及其潜在的调控机制提供线索。
图2 疾病相关少突胶质细胞分析（图片引自文献[2]）
3.发现染色质开放先于基因表达启动的谱系动力学特征
2020年Cell针对同一细胞中转录组和染色质可及性的方法学研究中[3]，通过表皮/皮层发育轨迹研究发现调控染色质域（DORC）通常在其相关基因表达开始前变得可及，这与谱系启动的动力学特征一致。以Wnt3基因为例，其早期增强子、二级增强子、启动子、内含子、外显子依次达到峰值，也就是说其DORC首先变得可接触，然后才有了新生的RNA，染色质开放和基因表达之间存在一定的时间差。因此，通过细胞发育和分化过程中染色质可及性的动态变化分析能够反映谱系启动的状态，染色质可及性可能在比转录组表达速度更快的时间尺度上预测未来的细胞状态。
图3 染色质的谱系动力学和表达决定谱系启动（图片引自文献[3]）
4.探索细胞命运的决定因素，预测细胞命运
2021年Cell针对人大脑皮层的多组学研究中[1]，通过基因共表达模块分析发现了三个周期相关的模块，并发现存在一种多能神经胶质原细胞，通过染色质可及性可以区分出两种不同的星形胶质细胞样表达模式。为探索影响这些命运的决定因素，进行不同模块相关的转录因子注释，发现每个分支至少含有一个相关的螺旋-环-螺旋家族的转录因子，且这些转录因子可以竞争类似的结合位点来驱动多个不同的细胞命运。这一观察结果表明，这些周期细胞中相关的染色质模式已经显示出高级转录细胞状态的特征，可以根据其染色质开放状态初步预测其细胞命运。
图4 染色质状态预测其细胞命运（图片引自文献[1]）
二、解析细胞类型特异性遗传突变与表型的关系
非编码基因组区域的突变，以及染色质调节因子的功能缺失突变，与精神分裂症和自闭症谱系障碍（ASD）等精神类疾病有关。染色质状态的细胞分辨率数据可能为这些突变和发育中的不同细胞类型的选择提供了重要的联系。
1.预测调控区突变引发的疾病风险
2021年Nature针对人脑皮层发育的多组学研究中[4]，揭示了基因组非编码区域的染色质开放性引发精神类疾病的潜在风险。文章将单细胞多组学数据中特定细胞类型的Peaks所在基因组区域与自闭症（ASD）、神经发育延迟（NDD）等精神类疾病的相关基因集的启动子区域进行位置重叠性的富集分析，发现它们存在显著的共定位关系。通过将单细胞多组学数据中预测的不同细胞类型的增强子与精神分裂症（SCZ）、双向情感障碍（BP）、重度抑郁症（MDD）和ASD等精神类疾病的神经元增强子集进行富集分析，发现它们的富集显著性很强。因此将单细胞多组学的数据与疾病已知的突变基因的数据结合，有助于揭示染色质开放性引发疾病的潜在风险。
图5 评估非编码区域突变的潜在调控影响（图片引自文献[4]）
2.发现遗传风险位点相关的细胞类型特异性顺式调控机制
2021年Nature Genetics针对阿尔兹海默病（AD）的多组学研究中[2]，为进一步探究AD遗传风险信号，结合已有的GWAS研究，将染色质可及性信号与GWAS 发现的SNPs进行关联。沿着小胶质细胞的拟时间轨迹进行研究，发现基因远端峰的富集显著增加，而近端峰显著降低，表明疾病相关小胶质细胞（DAM）远端增强子上可能具有与AD相关的SNP。此外，少突胶质细胞的研究发现了四个与AD诊断显著相关的共表达模块OM1、OM2、OM4和OM5，其中三个少突胶质细胞模块显著富集了SREBF1的靶标，表明SREBF1在调节这些模块中的基因表达方面的重要性，可作为AD治疗的候选靶点。该研究表明，单细胞多组学的数据与疾病突变基因的数据联合分析在确定新的疾病基因靶点方面的实用性。
图6 AD遗传风险位点的细胞类型特异性顺式调控（图片引自文献[2]）
3.利用多组学图谱解释ASD中的非编码突变
2021年Cell针对人大脑皮层的多组学研究中[1]，研究者构建了深度学习模型，试图用多组学图谱解释ASD中的非编码突变。为预测候选突变对染色质可及性的特异性影响，计算病例与对照组中突变的富集情况，观察到谷氨酸能神经元（GluN2/3/4/6/9）的ASD相关突变显著富集(>1.2倍)。此外，根据模型还发现了一个位于NFIA的内含子高度破坏性突变，该基因的功能丧失突变此前已被认为与自闭症有关。该结果表明，针对细胞类型的深度学习模型将DNA序列突变信息与染色质的可及性联系起来，可以用来评估非编码突变的潜在调控影响，且有助于发现疾病相关的非编码突变。
图7 深度学习模型优先处理ASD中的破坏性非编码突变（图片引自文献[1]）
三、总结
单细胞ATAC+基因表达多组学基础版研究思路中，已初步探究了细胞类型特异性转录调节机制，Plus版研究内容一般会更加深入的探究细胞分化发育或疾病表型相关的调控机制。如探究转录调控的动态发生机制，解析细胞类型特异性遗传突变与表型的关系等。总体而言，可以看出，单细胞ATAC+基因表达多组学能够将基因表达与调控元件的可及性联系起来，定义独特细胞类型的调控元件和细胞状态，解释基因表达差异的原因，揭示与肿瘤、疾病相关基因调控网络，预测细胞发育分化的命运，更准确地重建细胞生理学基础的分子过程。基于多组学对调控机制研究的诸多便利，单细胞ATAC+基因表达的多组学结合的研究模式已逐渐成为CNS文章的“新宠”。多组学研究思路总结如下：
图8 单细胞多组学一般研究思路总结
参考文献：
1. Trevino AE, Müller F, Andersen J, et al. Chromatin and gene-regulatory dynamics of the developing human cerebral cortex at single-cell resolution[J]. Cell, 2021, 184(19):5053-5069.e23.
2. Morabito S, Miyoshi E, Michael N, et al. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease[J]. Nature Genetics, 2021, 53(8):1143-1155.
3. Ma S, Zhang B, LaFave LM, et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin[J]. Cell, 2020, 183(4):1103-1116.
4. Ziffra RS, Kim CN, Ross JM, et al. Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development[J]. Nature, 2021, 598(7879):205-213.
