医学生物信息学文献第5期：非小细胞肺癌靶向治疗应答的早期无创检测

随着精准肿瘤学的出现，靶向治疗给越来越多的患者带来了生存获益。目前，临床上用于评判治疗效果和检测的手段主要有CT影像和组织活检，但是传统的检测方法无法快速检测肿瘤对药物的治疗反应以及肿瘤基因变化，并且频繁的CT影像易导致二次肿瘤的发生，组织活检是具有潜在并发症的侵入性手术，很少能发现肿瘤内部和肿瘤间异盾性的复杂性。临床中迫切需要开发可以实时、无创检测肿瘤对靶向治疗效果的新监测方法。本研究旨在通过对28位晚期肺癌患者血样中ctDNA(循环肿瘤DNIA)进行检测，开发出一种通过游离细胞肿瘤负荷(cfTL)测量评估肿瘤负荷的方法，该测量结合了许多驱动基因的序列变化以及全基因组结枸变化，允许检测分析所有患者中肿瘤相关的改变，分析了患者血样中肿瘤细胞的基因突变和染色体变化异常，并与CT影像结果进行对比，达到实时追踪治疗期间肿瘤负荷情况的目的。

cfTL测定原理图及治疗反应预测

对接受酪氨酸激酶抑制(TKI)治疗的转移性非小细胞肺癌(mNSCLC)患者进行基线和治疗后连续时间点的液体活检。TEC-Seq方法用于直接鉴定58个基因的序列改变，包括测序至＞30,000x覆盖的80,93个碱基，并且用全基因组方法鉴定cfDNA中的拷贝数变化。cfTL被定义为TKI靶向治疗中已检测到序列变化的患者靶向克隆中最丰富变化的突变等位基因片段，或基于PA评分确定没有可检测序列变化的患者是否存在非整倍体。在没有进行TKI治疗时对患者进行抽血，该点的cfTL为基线，在开始TKI治疗后进行数小时至数天的连续抽血，分析cfTL的动态变化，通过治疗后cfTL从基线到后续时间点的变化，可以实时评估患者对靶向治疗的反应，而CT影像要在治疗开始后5-7周对治疗效果进行反应评估。

治疗过程中ctDNA的动态变化

图2A，患者CGPLLU12，为奥斯替尼应答者治疗过程中的ctDNA变化，Z值评分和CT影像结果：图2B，患者CGPLLU244，为奥斯替尼无应答者治疗过程中ctDNA变化，Z值评分和CT影像结果。通过TEC-Seq方法鉴定的cfDNA克隆的突变等位基因片段显示了每个时间点的分析结果，亮绿色为ctDNA克隆，代表cfTL，红色箭头代表治疗开始：从全基因组数据分析中确定的cfDNA拷贝数的变化在每个时间点上显示为每个染色体臂的Z值（紫红色点）和PA值（中间橙色菱形)：灰色方块为在治疗过程中每隔一段时间用CT扫描测量的RECIST1.1的最长直泾总和(SLD)(上)；红色圆圈表示CT图像中每个患者有代表性的肿瘤病灶。对于奥斯替尼应答者，在治疗开始到第十天，ctDNA、Z值和PA值明显下降，表明患者已对奥斯替尼出现应答，而CT影像在治疗后的55天才检测出应答反应：CT影像得到的SLD表明应答患者在治疗8天后开始出现进行性疾病，而ctDNA、Z值和PA值在大约十天左右就能预测出患者的进行性疾病。对于奥斯替尼无应答者，在治疗开始后，通过ctDNA、Z值和PA值就可以预测其进行性疾病，而CT影像只能在37天后才能检测到。这些结果表明ctDNA分析比CT影像能更早预测患者的治疗效果。

酪氨酸激酶抑制剂治疗患者的游离细胞DNA特征

治疗开始后，从基线到ctDNA评估时，部分应答(蓝色)、稳定疾病(橙色)和进行性疾病(红色)患者的cfTL(A)和血浆突变敷(B)的变化。部分应答亚组还包括两名由RECIST诊断为不可测量疾病的患者，他们被归为临床反应者。图3A，所有对靶向治疗有初步客观影像学应答的患者显示cfTL显着降低，突变等位基因浓度从基线时的平均10.80%降至治疗开始后中位时间19天时的0.18%:在影像学稳定的患者中，突变等位基因浓度从基线时的平均2.24%降低到治疗开始后的1.04%:相比之下，通过序列和染色体改变测量，所有5名有影像学进展性疾病患者的cfTL变化均有限，范围从基线时的平均突变等位基因分数14.23%到开始治疗后的11.84%。图3B，除了cfTL的变化之夕卜，在应答者中观察到每个患者突变的平均变化数量也从3.6减少到1.1，而患有稳定或进展性疾病的患者在治疗期间观察到的突变数量没有显着变化。这些观察结果表明，在应答患者的早期时间点ctDNA水平和克隆异质性均显着降低，并且在无应答的患者中，肿瘤亚克隆的出现和生长可以比影像学进展更早地检测到。

酪氨酸激酶抑制剂启动后数小时内检测ctDNA变异

8例患者在基线和开始治疗后4-12小时的ctDNA(A)和cfDNA提取物(B)水平的变化。红色为新出现的ctDNA改变和具有这些改变的患者相应的cfDNA量。图4A，ctDNA水平的提高可以识別8种以前未在基线检测到的肿瘤衍生性改变，新检测到的克隆的突变等位基因片段范围为0.15%至1.70%，平均为0.57%，表明这些改变可能低于基线检测限并且由于ctDNA水平的增加而检测到。图4B，治疗后4-12小时，cfDNA的量在基线和时间点之间保持相对稳定，这表明ctDNA水平的变化是由于cfDNA内突变克隆的相对丰度发生了变化。这些观察结果表明，新的ctDNA变体的出现可能与治疗的早期效果有关。

ctDNA的变化和对治疗反应的预测

作者评估了治疗开始后早期时间点观察到的动态cfTL变化是否与临床结果的差异相关。图5A，早期cfTL水平呈双峰分布，较低组cfTL平均降低99.8%，较高组cfTL平均升高0.06%，cfTL降低＞98%且<98%的患者分別被归类为ctDNA应答者和ctDNA无应答者。图5B，对于分析的患者，描绘了ctDNA评估时的cfTL（蓝色）和PFS（橙色）。影像学评估在右栏中表示为部分应答（PR），稳定疾病（SD），不可测量疾病（NM）或进行性疾病（PD）。患者CGPLLU244在ctDNA评估时具有＞100%的cfTL水平（*）。12例ctDNA完全应答（cfTL降低100%）的患者中有8例无进展生存超过1年，在6例影像学稳定的患者中，ctDNA分析发现4例患者有分子应答（平均PFS为11.3个月），2例患者无分子应答（平均PFS为2.6个月）。一名患者是影像学部分应答者但分子无应答者的PFS为3.9个月。重要的是，2例经RECIST诊断为不可测量疾病的患者被明确为分子应答者，平均PFS为13.7个月。使用ctDNA分析，可以更准确地对影像学上无法测量的疾病患者和首次影像学评估时病情稳定的患者进行分类。图5C，ctDNA应答者和无应答者的无进展存活期。图5D，基于初始影像学评估的无进展生存。图5E，应答时间评估由CT扫描（蓝色）或ctDNA分析（橙色）确定，用虚线表示评估的中位时间。图5C，D，E三图表明与ctDNA应答者相比，ctDNA无应答者中位无进展生存期显著缩短(1.6个月vs.13.7个月)，此外，与开始治疗后CT成像评估的平均47天中位时间相比，cfTL评估的19天中位时间更准确地预测了临床结果。

研究意义：

这项研究开发的游离肿瘤负荷为评估系统性酪氨酸激酶抑制剂治疗期间ctDNA的纵向变化提供了一种新的方法，并满足了在影像学评估前实时、无创检测肿瘤对靶向治疗反应的临床需求，证明了液体活检在早期评估靶向治疗反应中的潜在价值，尤其是当CT检测无法有效判断患者客观缓解和实际疾病进展的时候。并且无创液体活检对于肿瘤特异性变化的强大识別功能，为多种治疗环境下不同类型癌症的广泛监控提供了可能，可以促进开发新疗法，改变癌症患者的治疗方式。后续研究空间：可以研究是否可以利用连续ctDNA监测来为非、卜细胞肺癌患者量身定制治疗策略。例如，(1)在最早检测到"分子耐药性"时，检查切換治疗方素是否会提高患者的生存率：(2）随着靶向联合治疗的选择不断扩大，可以利用系列ctDNA监测设计临床试验，研究早期治疗从单一治疗升级到联合治疗是否能改善临床结果。

总之，本研究通过对患者血样中脱落至循环血液的肿瘤细胞ctDNA的检测，对胂瘤细胞的基因突变和染色体变化异常进行了分析，迖到了治疗期间肿瘤负荷实时追踪的目的。同时与CT影像结果进行对比，ctDNA检测可以提前约四周检测患者的治疗效果，其结果更加精确。