分析胰腺癌患者KRAS-WT肿瘤分子特征 以发现新的致病驱动因

Molecular Characterization of KRAS Wild-type Tumors in Patients with Pancreatic Adenocarcinoma

胰腺癌患者中KRAS野生型肿瘤的分子特征分析

发表期刊：Clin Cancer Res

发表日期：2022 Jun 13

影响因子：13.801

DOI:  10.1158/1078-0432.CCR-21-3581

一、研究背景

        胰腺导管腺癌（PDAC）是一种具有挑战性的疾病，5年生存率只有10%。大多数PDAC患者都有转移性疾病，在最初发病时或随后出现，这强调了对更有效的系统性治疗的需求。

        KRAS（Kirsten大鼠肉瘤）突变是PDAC的一个标志，是其自然史上的一个早期事件，并与其生物学的关键方面有关，如炎症、免疫规避和代谢的改变。突变的KRAS是PDAC的主要致癌因素，也是一个有吸引力的治疗目标。然而，先前对PDAC患者的研究已经发现有一部分患者（10-20%）的肿瘤根本没有已知的KRAS突变。这些KRAS野生型肿瘤可能与KRAS突变的PDACs有生物学差异，并可能提供该亚群所特有的治疗机会。

二、材料与方法

1、数据来源

1）被诊断为PDAC的患者的肿瘤组织是通过手术标本或图像引导的活检获得的组织

2）来自2021年更新的真实世界证据（RWE）数据库的大型队列的保险数据的治疗和生存信息被纳入生存分析；生物标志物分析中的肿瘤是RWE数据库的一部分

2、分析流程

1）DNA的下一代测序（NGS）：使用NextSeq或NovaSeq平台（Illumina, Inc., San Diego, CA）对从福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本中分离的基因组DNA进行NGS

2）肿瘤突变负担（TMB）：TMB是通过计算每个肿瘤中发现的所有非同义错义、无义、框内插入/删除和框架移位突变来衡量的

3）MSI/MMR状态：使用多种测试平台的组合来确定肿瘤的MSI，或MMR熟练状态，包括片段分析（FA，Promega，Madison，WI）、免疫组化（IHC）（MLH1，M1抗体；MSH2，G2191129抗体；MSH6，44抗体；和PMS2，EPR3947抗体）和NGS

4）RNA测序：所有纳入分子研究的肿瘤也使用下一代RNA测序（RNA-Seq）进行检测

5）肿瘤微环境特征和MAPK激活评估：利用转录组数据，MCP-计数器用于量化基质细胞群的丰度，而QuantiSeq则用于量化免疫细胞的浸润；通过MPAS计算评估MAPK的激活情况

6）PD-L1的表达：IHC是在玻璃玻片的FFPE切片上进行的

三、实验结果

01 - 研究人群和KRAS状态

        研究人群包括2483名患者，其中53.7%为男性，中位年龄为66岁（范围22-95岁）。在总数中，266人（10.7%）是KRAS WT。PDAC占分析样本的92.5%，类似的KRAS WT比例为10.1%。该研究还包括额外的组织学亚型，包括粘液性、腺鳞状癌和肉瘤等，占另外7.5%。胰腺尖锐湿疣细胞癌尤其富含KRAS WT（82%）。2个假性乳头状瘤中有2个是KRAS WT。性别或年龄与KRAS野生型状态没有关系（男性为11%，女性为10%）。KRAS WT和MT的中位年龄分别为66和67岁。大多数的突变是G12D（43%）、G12V（31%）和G12R（14%）。最常见的KRAS改变是第12位的甘氨酸被天冬氨酸取代（G12D）（962/2234 = 43.1%），第12位的甘氨酸被缬氨酸（G12V；30.8%）和精氨酸（G12R；14.2%）取代。只有1.9%的患者出现了潜在的可靶向的G12C突变。17个肿瘤表达了一个以上的KRAS突变。总体而言，反复出现的KRAS突变只涉及甘氨酸12、谷氨酰胺61和甘氨酸13。几乎所有的突变（>99%）都是单点突变，插入和删除的数量可以忽略不计。

02 - RAS WT亚组的改变

        通过全外显子组测序、全转录组测序和IHC（图1）分析了233个KRAS WT PDAC的改变情况。最经常突变的基因是TP53（44.5%）。BRAF是KRAS的一个下游效应因子，突变频率第二高（13.0%）。与黑色素瘤和CRC中V600E突变构成绝大多数BRAF突变不同，在KRAS WT PDAC组中，大约三分之一（37%）的BRAF突变涉及V600（第1类），而RAS无关的突变（第2类）最常见（43%）；RAS依赖的突变（第3类）最不常见（17%）（图1C）。5 AA段的缺失（N486_P490del）是最常见的RAS非依赖性BRAF突变，而D594N是最常见的RAS依赖性突变。多个突变见于DNA损伤修复途径基因（BRCA2：5.2%，ATM：4.7%，BAP1：2.9%，RAD50：2.3%，FANCE：2.1%，PALB2：2.1%），参与染色质重塑的基因（ARID1A：11. 6%，PBRM1：5.6%，ARID2：3.9%，KMT2D：3.4%，KMT2C：3.8%，SMARCA4：2.2%，SETD2：1.8%），和细胞周期调节（CDKN2A：10.3%，CCND1 amp：2.6%，CCNE1 amp：2.3%）。KRAS WT PDACs还表现出FGF3（3%）、ERBB2（2.2%）、FGFR3（1.8%）、NTRK（1.8%）、MET（1.3%）的拷贝数扩增。综上所述，超过10%的KRAS WT PDACs表现出扩增，可能对已知的靶向治疗有好处。

图1 在KRAS-WT肿瘤中看到的分子改变

        对KRAS WT和MT PDAC之间基因组改变的显著差异进行分析，发现与关键癌症相关基因的改变有关联。当分析与免疫检查点抑制剂疗法相关的改变时，与KRAS MT肿瘤相比，KRAS WT PDAC更可能是MSI-高/MMR-缺陷（4.7% vs 0.7%；p<0.05）和TMB-高（4.5% vs 1%；p<0.05）（图2）。然而，在KRAS WT（15.8%）和KRAS MT（17%）之间，PDL1的表达没有明显的统计学差异。

图2 比较KRAS WT和MT肿瘤中与免疫检查点抑制剂相关的生物标志物

        众所周知，参与肿瘤发生和转移的典型肿瘤抑制基因包括TP53、CDKN2A和SMAD4突变在KRAS MT PDAC中更为普遍，然而，绝大多数在WT和MT之间有明显差异的改变被认为在WT肿瘤中富集，包括可靶向的改变（例如，BRAF、ALK、ROS1、FGFR2、NRG1、MSI-H、IDH1、RET）（图3）。

图3 比较KRAS MT与WT肿瘤的分子改变

        图4显示了233个KRAS WT PDAC肿瘤的肿瘤图，详细说明了与免疫疗法相关的标志物、基因融合、突变和扩增情况。值得注意的是，虽然KRAS MT肿瘤基本没有基因组融合事件，唯一的例外是MET融合（见于KRAS MT队列中的1例），但21%的WT肿瘤（233例中的50例）被确认存在基因融合事件，涉及BRAF（6.6%）、FGFR2（5.2%）、ALK（2.6%）、RET（1.3%）、NRG1（1.3%）和RAF1（1.3%）等。这些基因融合事件和其他致癌性改变在大多数病例中显示出相互排斥性。

图4 显示233个PDAC肿瘤的分子改变的肿瘤图谱

        由于在KRAS WT PDAC中发现的许多基因组改变与MAPK途径的激活有关，在没有KRAS突变的PDAC中可能成为另一种致癌驱动因素，作者使用以前发表的10个基因签名，MAPK途径活动评分（MPAS）来评估MAPK途径的活性。与KRAS WT队列相比，KRAS MT PDAC的MAPK活性明显升高；与一组没有MAPK通路突变的KRAS WT肿瘤相比，NF1突变、RAF1融合、BRAF融合和突变的MPAS都较高（补充图1）。

补充图1

        RNA去卷积分析被用来描述免疫微环境的特征（Quantiseq）。在KRAS WT PDAs中观察到骨髓树突状细胞、NK细胞和CD8+T细胞的统计学意义上的差异（图5A）。相反，KRAS WT PDACs中的中性粒细胞明显减少。B细胞在KRAS WT PDAC中的数量增加，但在进行多重比较后，这一差异没有达到统计学意义。基质细胞群的估计显示，WT肿瘤中的成纤维细胞减少，KRAS WT肿瘤中的内皮细胞增加（图5B）。由于MSI-H/dMMR导致基因组突变和细胞表面新抗原的产生，可能会诱发不同细胞淋巴细胞群的浸润，作者进一步分析了确认MSS/pMMR状态的肿瘤的免疫细胞群，并比较了有无KRAS突变的肿瘤。如图5所示的所有重要结果在MSS队列中都成立，表明观察到的免疫-微环境差异是KRAS突变所特有的，而不是MSI-H/dMMR的次要影响。

图5 比较KRAS MT与WT肿瘤的TME特征

03 - 治疗和结果分析

        使用NextGen测序平台（NextSeq或Novaseq），共有5324名胰腺癌患者被检测为KRAS WT（N=705）或KRAS MT（N=4619）。与KRAS MT患者相比，KRAS WT患者的总生存期（从组织采集到最后一天接触计算）有小幅但有统计学意义的延长（图6A；如果只分析有远处转移的患者数据，生存期的改善更为突出（图6B）。在接受5FU和奥沙利铂治疗的患者（图6C）和接受吉西他滨和纳布-紫杉醇治疗的患者（图6D）中，KRAS WT患者与KRAS MT对应的患者相比，总生存期增加。在KRAS WT队列中，通过作者使用火山图分析探讨了在总生存期较长的患者中更为丰富的分子改变，并观察到TP53野生型状态与较长的生存期有关：与野生型相比，TP53突变的患者的总生存期明显下降（图6E）。

图6 KRAS MT和KRAS WT肿瘤中的OS

四、结论

        总之，具有KRAS WT状态的PDAC患者代表了一个独特的亚组，他们可能从全面的分子分析中受益，以改善他们的治疗效果。在PDAC的常规管理中应考虑多基因分析，包括确定KRAS状态作为初步诊断工作的一部分。未来的研究将集中在识别KRAS WT人群中的预测性转录组特征。