Dependency of a therapy-resistan

本文选自nature，2017年的文章，喜欢的可以自行下载阅读。

细胞状态的可塑性被认为是导致对多种癌症疗法产生抗药性的原因，从而限制了它们的有效性（也就是EMT其实）。在人类肿瘤和癌细胞系中观察到的一种高间充质细胞状态与不同癌症谱系对多种治疗方式的耐药性有关，但这种状态的机制基础仍不完全清楚。在这里，我们从分子上描述了人类癌细胞系和有机体中这种耐药的高间质细胞状态，并表明它依赖于一种可抑制铁死亡的脂质过氧化物途径，我们表明，这种细胞状态的特征是促进多不饱和脂质合成的酶的活性。这些脂质是脂氧合酶酶进行脂质过氧化的底物。这种脂质代谢依赖于聚集在磷脂谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx4)上的途径，Gpx4是一种含硒半胱氨酸的酶，可以驱散脂质过氧化物，从而阻止铁介导的过氧化物反应.研究发现，对Gpx4的依赖性存在于以ZEB1高表达为特征的多种耐药状态，包括上皮源性癌症的上皮-间充质转化、黑色素瘤的转化生长因子β介导的治疗耐药、前列腺癌治疗诱导的神经内分泌转分化以及肉瘤，这些肿瘤由于其起源的细胞而固定在间质状态。我们发现，在不同的间质细胞状态下，抑制脂质过氧化物酶途径导致的铁死亡是耐药癌细胞的一个特征。

我们假设培养细胞存在不同状态，通过挖掘肿瘤细胞系对活性与体细胞系表达抗性标志相关的化合物的敏感性可以用来研究抗性状态细胞的弱点，为了探索这一点，我们选择了三个细胞和患者来源的高间质状态的签名。我们首先计算了516个上皮来源的癌细胞(癌症)的间质评分，用于产生癌症治疗反应门户网站上可用的小分子敏感性测量。基因表达数据从CCLE门户网站获得。我们使用与治疗耐药相关的间充质状态的基因表达签名进行了单样本基因集富集分析。将这些细胞系间充质分数与细胞系敏感性的曲线下面积(AUC)度量(从16个浓度一式两次测量)关联到481个性能不同的化合物，产生了一系列化合物敏感性-间充质分数相关系数(图1A和补充表2)。酪氨酸激酶抑制剂可以抑制上皮癌细胞靶点(例如表皮生长因子受体)，是与上皮细胞状态敏感性最相关的化合物之一，增加了我们对这一方法的信心(图1A)。此外，ML239，一种最初被确定为具有优先杀死经过EMT诱导的乳腺癌细胞的能力的化合物，最近被证明可以增加癌细胞中的不饱和脂质水平，与间质状态敏感性相关，进一步验证了这一策略(图1A和补充表2)。

除了脂质修饰化合物ML239，两类不同的化合物与具有高间充质状态基因表达分数的上皮癌细胞系的选择性诱导细胞死亡强烈相关(图1A)。第一类包括RSL3、ML210和ML162，已知可诱导铁死亡，这是一种涉及脂质过氧化的非凋亡、氧化形式的调节性细胞死亡(图1B)。第二类包括氟伐他汀、洛伐他汀酸和辛伐他汀，抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)的化合物(他汀类)(图1B)。我们将这七个化合物统称为间充质状态靶向化合物。

八种胰腺和胃癌细胞系的E-cadherin(一种典型的上皮状态标志物)的低水平和Vimentin(一种间质状态的标志物)的高平与细胞系对间质状态靶向化合物的敏感性之间的相关性进一步验证了这些化合物的间质状态靶向效应(图1C和扩展数据图1、2)。除了对高表达间充质状态基因的上皮癌细胞株表现出选择性外，诱导铁死亡的间充质状态靶向化合物对于间充质起源的癌细胞系(肉瘤)是最具选择性的化合物(图1D)。来自卵巢癌和肾癌的细胞系也显示了铁死亡诱导间充质状态靶向化合物的选择性靶向(图1D)。我们假设这源于卵巢和肾脏的间充质中肾胚胎起源，并保留了间充质状态，即卵巢和肾癌在这些组织中的易损性。

使用可公开获得的349个癌细胞系的全基因组短发夹状RNA(ShRNA)敏感性数据，我们发现，细胞系对Gpx4基因敲除的敏感性是对铁死亡诱导的化合物子集敏感的相关性最高(图2A和扩展数据图3)。这表明这些化合物的特征在于它们独特的抑制Gpx4的能力，鉴于Gpx4被确认为RSL3的相关直接靶标，这一假说特别吸引人。

他汀类药物是HMGCR的小分子抑制剂，它们可能通过影响硒代半胱氨酸荷电转移rna(Trna)的异戊烯化(作为硒代半胱氨酸-tRNA成熟的一部分)来介导它们选择性诱导高间质状态癌细胞的细胞死亡(图1A)。

他汀类药物通过甲羟戊酸途径抑制焦磷酸异戊烯酯的产生，从而抑制硒蛋白的生物合成。他汀类药物和直接Gpx4抑制剂在CTRP AUC相似矩阵(图2B)的层级聚类中相邻聚类(旨在识别在数百个癌细胞系中具有相似敏感性模式的化合物)，支持他汀类药物的作用机制，该机制与直接Gpx4抑制剂密切相关，但与直接Gpx4抑制剂不同。

用氟伐他汀处理细胞后，Gpx4的表达以时间和浓度依赖的方式减少(图2C和补充图1)，并与直接Gpx4抑制剂RSL3(图2D)协同处理。与直接Gpx4抑制剂的作用不同，他汀类药物的治疗不能被脂溶性抗氧化剂拯救(扩展数据图5)。

然而，他汀类药物治疗导致细胞脂质过氧化水平增加(图2e)，这与抑制Gpx4蛋白表达一致。

为了更深入地了解高间质状态和Gpx4依赖性之间的关系，我们分析了几个模拟癌症相关间充质状态的等位基因细胞系。由强制表达EMT转录因子SNAIL1(也称为SNAI1)或Twist1衍生的高间质状态癌细胞对Gpx4抑制没有显示出一致的敏感性(扩展数据图6)。相反，我们发现EMT调节因子和脂质生成因子ZEB1与间充质状态对Gpx4抑制的敏感性密切相关(图3A)。更重要的是，ZEB1缺失消除了对Gpx4抑制的敏感性(图3B，扩展数据图7和补充图1)，表明ZEB1对于高间质状态细胞对Gpx4的依赖是必需的。

靶向治疗后出现的高间质状态代表了另一种耐药间充质癌细胞状态的等位基因模型。我们发现，与亲本HCC4006细胞相比，获得高间质状态并对gefinitib具有耐药性的HCC4006非小细胞肺癌细胞对Gpx4抑制具有优先敏感性(图3C和扩展数据图8)。

两个患者来源的胰腺癌细胞系被发现对Gpx4抑制剂的敏感性与间质状态蛋白标记物的水平呈正相关，而与对厄洛替尼的敏感性呈负相关(扩展数据图1)。前列腺癌背景下的神经内分泌转分化可以产生耐药细胞，间质状态基因的表达增加。在一组表现出一系列上皮和间质特征的患者来源的前列腺癌类器官和良性前列腺细胞中，我们发现治疗诱导的、高ZEB1的神经内分泌转变与Gpx4依赖有选择性地相关(图3D和扩展数据图8)。

在BRAF突变型黑色素瘤的背景下，在人类肿瘤中观察到的一种非突变细胞状态与靶向治疗和免疫治疗有关。这种黑色素瘤治疗耐受状态类似于激活的成纤维细胞(例如肌成纤维细胞)，其特征是包括AX1在内的间质标志物表达增加，黑素细胞系特异性转录因子MITF的表达降低，并且可以通过转化生长因子β1诱导对治疗敏感的细胞。

我们发现，这种黑色素瘤治疗耐药状态的基因表达特征与CTRP内对Gpx4抑制剂的敏感性密切相关(扩展数据图8)，用转化生长因子β治疗两个对治疗敏感的患者来源的黑色素瘤细胞系导致了对BRAF抑制的抵抗并诱导了Gpx4依赖(图3e)。

当我们试图证明Gpx4在活体中作为间充质状态依赖性保持完好时，我们遇到了现有Gpx4抑制剂的药代动力学缺陷，这排除了它们在动物中的使用。为了绕过这一挑战，我们使用了一种利用脂溶性抗氧化剂(例如，维生素E)，铁抑素-1挽救Gpx4缺失的影响。我们使用CRISPR-Cas9技术在一组癌细胞系(扩展数据图7和补充图1)中敲除Gpx4。这是在fer-1存在的情况下实现的，允许依赖于Gpx4的Gpx4基因敲除细胞存活。当存在fer-1时，上皮和间质状态的Gpx4敲除癌细胞的增殖速度与它们的野生型(Gpx4-野生型)癌细胞相当(图3F)。fer-1的退出揭示了Gpx4功能的丧失，导致间充质状态Gpx4基因敲除细胞中的铁死亡，而上皮状态Gpx4基因敲除细胞仍然没有受到影响(图3F)。

体外研究

我们通过优化小鼠的fer-1剂量策略，使依赖于Gpx4的Gpx4基因敲除的癌细胞能够存活，从而使这种方法适应于体内情况。我们产生了高间充质状态、耐药黑色素瘤细胞系LOXIMVI的Gpx4野生型和Gpx4基因敲除克隆的异种移植(图3g)。停止给药导致Gpx4基因敲除异种移植瘤选择性消退，而Gpx4野生型异种移植瘤继续快速生长(图3g)。这些结果表明，在细胞自主的情况下，间充质状态对Gpx4的依赖在体内保持完整，尽管在体外和体内的代谢环境之间存在潜在的差异。

Gpx4依赖性在采用耐药间充质状态的癌细胞中比在一组未转化的间充质细胞系中更为明显(扩展数据图9)。我们发现，通过用亲脂性抗氧化剂如维生素E(扩展数据图9；也见图4)预处理细胞，可以进一步扩大这种区分敏感性，这些抗氧化剂间接补充了Gpx4的作用。例如，与耐药癌细胞相比，维生素E的保护作用在未转化间充质细胞中持续时间更长，这让人想起在甲氨蝶呤治疗的背景下，转化细胞和未转化细胞之间的叶酸差异效应。

通过扰动和功能表征，我们定义了一个由13个不同的分子节点组成的通路，该通路构成了广泛相关的间充质治疗耐药状态及其对脂质过氧化物酶通路的依赖(图4)。这一途径集中在合成、储存和使用长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)(例如花生四烯酸)，这些脂肪酸容易通过脂氧合酶的作用变成活性性脂质过氧化物。Gpx4可以驱散这些反应性过氧化物，从而防止铁链细胞死亡。与这一模型一致，我们发现敲除PUFA代谢的上游调节因子(ACSL4，LPCAT3)9和抑制脂氧合酶可以防止由于抑制Gpx4而导致的细胞死亡(扩展数据图10)。

在这一主题上的趋同也与间充质状态靶向化合物ML239(图1A)作用于脂肪酸去饱和酶-2(FADS2)以促进多不饱和脂肪酸(PUFA)的生成一致，而多不饱和脂肪酸是脂质过氧化的底物(图4)。相反，直接用过氧化脂质处理细胞并不显示对间充质状态细胞的选择性(扩展数据图10)。这一结果支持我们描述的耐药间充质状态的Gpx4依赖的特征不是对外源性亲脂过氧化物本身的敏感性，而是特定细胞脂质作为脂质氧化酶底物的倾向(扩展数据图10)。

ZEB1，我们将其与Gpx4依赖性(图3B)因果联系，提供了间充质基因表达和脂质过氧化脆弱性之间的桥梁。ZEB1已被证明在细胞脂质新陈代谢中发挥重要作用，部分是通过直接转录调节脂质生物的主要调节因子PPARγ。越来越多的证据表明，ZEB1调节脂质的摄取、积累和动员，并影响EMT相关的质膜重塑，这是脂氧合酶介导的多不饱和脂肪酸氧化发生的地方。由此产生的ZEB1高的细胞对脂质过氧化物酶活性的依赖可以通过直接抑制Gpx4最有效地利用，但也可以通过抑制Gpx4生物合成(他汀类药物)和调节Gpx4辅因子谷胱甘肽(Erastin，丁硫氨酸亚砜)水平的代谢途径的远端扰动来达到目的(扩展数据图8)。

凋亡级联的失调是处于治疗抵抗状态的癌细胞的特征，这可能解释了它们对不同治疗模式的广泛抵抗。我们的结果表明，这些细胞经历铁死亡的能力增强了，更广泛地说，这里提出的结果说明了一种理解和克服癌症治疗耐药性的方法，它超越了基于驱动癌基因和耐药性突变的传统方法。