Day 11 充分理解GSVA和GSEA
第一：要下载相应的GSEA基因集
第二：关于GSEA 理解输入输出
1.需要输入一个geneList选取差异表达的基因
2.需要输入gmts数据集（从GSEA官网下载）：
d='./MsigDB/symbols'
gmts <- list.files(d,pattern = 'all')
gmts3.lapply函数是对gmts基因集的循环，如果下载全基因集或者只关注一个基因集，那就不需要循环：如注释信息 # gmtfile=gmts[2]:相当于只取第二个基因集
- geneset <- read.gmt(file.path(d,gmtfile)) ：用read.gmt 这个函数读取gmt文档信息
- egmt <- GSEA(geneList, TERM2GENE=geneset, verbose=FALSE)
head(egmt)：相当于还是主函数。主要的数据分析gseaplot(egmt, geneSetID = rownames(egmt[1,])) ：选取了一条基因集画图：选取的基因集的名字是rownames(egmt[1,])
7： gsea_results_list<- lapply(gsea_results, function(x){
cat(paste(dim(x@result)),'\n')
x@result
}) ##########这个的意思应该是吧gsea_results进行了操作列出 gsea_results_list8：gsea_results_df <- do.call(rbind, gsea_results_list) ###########把gsea_results_list做转化成data.frame。do.call神奇操作
9：gseaplot(gsea_results[[2]],'KEGG_CELL_CYCLE') 。选择有差异的基因集进行画图。此处要注意gsea_results[[2]]其中的数字2 要和KEGG_CELL_CYCLE是对应的。所以画图前一定要用notepad++查看下载下来的基因集和数字的对应关系。
load(file = 'anno_DEG.Rdata')
geneList=DEG$logFC
names(geneList)=DEG$symbol
geneList=sort(geneList,decreasing = T)
#选择gmt文件（MigDB中的全部基因集）
d='./MsigDB/symbols'
gmts <- list.files(d,pattern = 'all')
gmts
#### 第二：关于GSEA的理解
library(GSEABase) # BiocManager::install('GSEABase')
## 下面使用lapply循环读取每个gmt文件，并且进行GSEA分析
gsea_results <- lapply(gmts, function(gmtfile){
# gmtfile=gmts[2]
geneset <- read.gmt(file.path(d,gmtfile))
print(paste0('Now process the ',gmtfile))
egmt <- GSEA(geneList, TERM2GENE=geneset, verbose=FALSE)
head(egmt)
# gseaplot(egmt, geneSetID = rownames(egmt[1,]))
return(egmt)
})
# 上面的代码耗时，所以保存结果到本地文件
save(gsea_results,file = 'gsea_results.Rdata')
#提取gsea结果，熟悉这个对象
gsea_results_list<- lapply(gsea_results, function(x){
cat(paste(dim(x@result)),'\n')
x@result
})
gsea_results_df <- do.call(rbind, gsea_results_list)
gseaplot(gsea_results[[2]],'KEGG_CELL_CYCLE')
gseaplot(gsea_results[[2]],'FARMER_BREAST_CANCER_CLUSTER_6')
gseaplot(gsea_results[[5]],'GO_CONDENSED_CHROMOSOME_OUTER_KINETOCHORE')
}
第三：GSVA的输入输出
计算每个样本在基因集中的富集程度，然后计算Fold change 和P value。做类似于热图的图。所以后面的很多算法和制作热图一致。
关注input：函数需要输入X=dat这个expression data，另外还需要gmt这个数据集
d='./MSigDB/symbols/'
gmts=list.files(d,pattern = 'all') 通过list.files这个可以列出当前路径下的所有gmt文件es_max <- lapply(gmts, function(gmtfile) ；使用lapply函数进行循环，对内一个下载的基因集进行操作；如果我们只关心一个基因集，就不需要这个循环了比如 #gmtfile=gmts[8]
geneset <- getGmt(file.path(d,gmtfile))
es.max <- gsva(X, geneset,
mx.diff=FALSE, verbose=FALSE,
parallel.sz=1)#######这一步很重要，是函数的最重要步骤。geneset <- getGmt(file.path(d,gmtfile)) 通过这个getGmt这个函数可以从gmt 文件中获得geneset；gsva这个主函数通过输入X这个表达矩阵和geneset数据集进行计算Fold change 和P value。
5adjPvalueCutoff <- 0.001
logFCcutoff <- log2(2)####进行阈值调整6.帅选差异表达的基因集##类似做热图和火山图（因为实验设计是本身存在不同的分组信息）；
6.1
es_deg <- lapply(es_max, function(es.max)这个函数对所有的基因集得到的es.max进行循环操作
6.2
分组内容如下：design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(es.max)6.3 deg = function(es.max,design,contrast.matrix) 这个函数对es.max按照分组信息进行基因集富集情况进行差异分析（类似于寻找差异表达基因）
7.最终会输出ex.max 和ex.deg这两个数据
8.最后作图，做差异富集的图，（类似差异表达的基因）作图的时候回报错，我标注在代码上：详见代码注释
### 对 MigDB中的全部基因集 做GSVA分析。
## 还有ssGSEA, PGSEA
{
load(file = 'step1-output.Rdata')
# 每次都要检测数据
dat[1:4,1:4]
library(hgu133plus2.db)
ids=toTable(hgu133plus2SYMBOL)
head(ids)
dat=dat[ids$probe_id,]
dat[1:4,1:4]
ids$median=apply(dat,1,median)
ids=ids[order(ids$symbol,ids$median,decreasing = T),]
ids=ids[!duplicated(ids$symbol),]
dat=dat[ids$probe_id,]
rownames(dat)=ids$symbol
dat[1:4,1:4]
X=dat
table(group_list)
## Molecular Signatures Database (MSigDb)
d='./MSigDB/symbols/'
gmts=list.files(d,pattern = 'all')
gmts
library(ggplot2)
library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
library(GSVA) # BiocManager::install('GSVA')
if(T){
es_max <- lapply(gmts, function(gmtfile){
#gmtfile=gmts[8];gmtfile
geneset <- getGmt(file.path(d,gmtfile))
es.max <- gsva(X, geneset,
mx.diff=FALSE, verbose=FALSE,
parallel.sz=1)
return(es.max)
})
adjPvalueCutoff <- 0.001
logFCcutoff <- log2(2)
es_deg <- lapply(es_max, function(es.max){
table(group_list)
dim(es.max)
design <- model.matrix(~0+factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(es.max)
design
library(limma)
contrast.matrix<-makeContrasts(paste0(unique(group_list),collapse = "-"),
levels = design)
contrast.matrix<-makeContrasts("TNBC-noTNBC",
levels = design)
contrast.matrix ##这个矩阵声明，我们要把progres.组跟stable进行差异分析比较
deg = function(es.max,design,contrast.matrix){
##step1
fit <- lmFit(es.max,design)
##step2
fit2 <- contrasts.fit(fit, contrast.matrix)
##这一步很重要，大家可以自行看看效果
fit2 <- eBayes(fit2) ## default no trend !!!
##eBayes() with trend=TRUE
##step3
res <- decideTests(fit2, p.value=adjPvalueCutoff)
summary(res)
tempOutput = topTable(fit2, coef=1, n=Inf)
nrDEG = na.omit(tempOutput)
#write.csv(nrDEG2,"limma_notrend.results.csv",quote = F)
head(nrDEG)
return(nrDEG)
}
re = deg(es.max,design,contrast.matrix)
nrDEG=re
head(nrDEG)
return(nrDEG)
})
}
gmts
save(es_max,es_deg,file='gsva_msigdb.Rdata')
load(file='gsva_msigdb.Rdata')
library(pheatmap)
lapply(1:length(es_deg), function(i){
# i=2
print(i)
dat=es_max[[i]]
df=es_deg[[i]]
df=df[df$P.Value<0.01 & abs(df$logFC) > 0.3,] #######在这里调阈值，保证输出
print(dim(df))
if(nrow(df)>5){ #######nrow(df)>5:只有差异富集的基因集大于五个以上才画图
n=rownames(df)
dat=dat[match(n,rownames(dat)),] ######n=rownames(df),筛选表达矩阵数据
ac=data.frame(g=group_list) ########对应后面的图中的annotation_col
rownames(ac)=colnames(dat)
rownames(dat)=substring(rownames(dat),1,50)
pheatmap::pheatmap(dat,
fontsize_row = 8,height = 11,
annotation_col = ac,show_colnames = F,
filename = paste0('gsva_',strsplit(gmts[i],'[.]')[[1]][1],'.pdf'))
}
})
adjPvalueCutoff <- 0.001
logFCcutoff <- log2(2)
df=do.call(rbind ,es_deg)
es_matrix=do.call(rbind ,es_max)
df=df[df$P.Value<0.01 & abs(df$logFC) > 0.5,]
write.csv(df,file = 'GSVA_DEG.csv')
}
