单细胞转录组和表观组学图谱揭示效应、记忆和耗竭CD8 T细胞在不
文章信息
文章题目：Longitudinal single cell transcriptional and epigenetic mapping of effector, memory, and exhausted CD8 T cells reveals shared biological circuits across distinct cell fates
期刊：bioRxiv
链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.27.485974v1
摘要
初始CD8 T细胞经受抗原刺激后可以增殖分化为效应（Teff）、记忆（Tmem）或耗竭（Tex）CD8 T细胞。这些不同的分化发育途径通常伴随着各自特异的转录和表观遗传特征的改变，从而赋予不同CD8 T细胞亚群特异的功能特性和免疫治疗潜能。目前，人们对CD8 T细胞的不同分化发育轨迹的潜在分子机制和Teff、Tmem和Tex细胞亚群的异质性特征仍知之甚少。在本文中，我们基于淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的急性和慢性感染模型，使用单细胞scRNA-seq和scATAC-seq数据的整合分析来解决这些问题。我们的分析结果揭示了新的细胞亚群子集，包括一个耗竭Tex细胞子群，它高表达NK细胞相关基因，以及在急性和慢性感染中鉴定到多个不同的TCF1+ 干/祖细胞样细胞亚群。这些数据还揭示了PD1 通路阻断对Tex细胞子集重塑的见解，并确定了细胞应激调节因子 Btg1 在 Tex 细胞分化中的关键作用。最后，我们的结果还强调了具有不同染色质景观的CD8 T细胞在不同分化发育途径中可以使用共享的生物学特征，如细胞毒性或干细胞/祖细胞性。因此，本研究的单细胞转录组和染色质可及性图谱阐明了CD8 T细胞发育生物学和调控 Teff、Tmem 和 Tex 细胞亚群分化的潜在分子机制。
背景
初始CD8 T细胞（Tnai）经受抗原刺激后，在急性感染或疫苗接种过程中可以增殖分化为效应（Teff）和记忆（Tmem）CD8 T细胞，而在慢性感染、癌症或自身免疫疾病发展过程中会分化为功能失调的耗竭（Tex）CD8 T细胞。近些年来，人们发现CD8 T细胞在不同分化发育途径中通常伴随着不同的转录和表观遗传特征的改变。然而，目前人们对不同CD8 T细胞亚群的异质性特征，以及细胞命运分化决定的潜在分子机制仍知之甚少。
在急性感染或疫苗接种的过程中，激活的CD8 T细胞会增殖分化为效应Teff细胞从而清除病原体以控制感染，并在清除病原后进一步分化为记忆Tmem细胞以维持长期的免疫保护。在CD8 T细胞的分化过程中，根据细胞表面蛋白标记、功能特性和分化潜能，人们已经鉴定出了不同的T细胞亚群。例如，根据KLRG1、CD127、CX3CR1或其他分子的表达，人们鉴定出了不同的Teff和Tmem细胞亚群，它们具有不同的效应活性和增殖分化潜能。然而，这些不同细胞亚群分化发育的潜在转录和表观遗传特征仍缺少详细的研究。
在慢性感染、癌症和自身免疫疾病的发展过程中，持续的抗原刺激会诱导CD8 T细胞向耗竭Tex细胞分化。类似于Teff和Tmem细胞，Tex细胞亚群也存在较大的异质性。目前，人们对Tex细胞亚群的功能和分化发育机制有着较大的研究兴趣，因为Tex细胞亚群中的特定子集可以响应免疫治疗，包括抗PD-1和过继T细胞疗法。尽管人们已经定义了多个不同的Tex细胞亚群，但大多数研究主要定义了以下几种细胞亚群：Tex祖细胞（或干细胞样、前体细胞），中间过渡态Tex细胞和终末分化的Tex细胞。作为一种特殊的T细胞亚群，Tex细胞与Teff和Tmem细胞相比有着自己独特的表观遗传特征，并且受到转录因子TOX的转录调控。尽管存在着较大的差异，Tex细胞与Teff和Tmem细胞仍然共享着一些共有的特征。如，Teff和Tex细胞都存在着细胞毒性，尽管Tex细胞的细胞毒性更小一些，Tmem和Tex细胞亚群的一些特定子集都可以进行长期的维持，尽管他们依赖不同的信号途径进行稳态维持。
目前，人们对于Teff、Tmem和Tex细胞的分化发育途径和异质性程度，以及潜在的转录和表观遗传调控机制仍知之甚少。部分原因是因为人们没有对不同分化发育途径中的CD8 T细胞进行配套的转录组和表观染色质可及性研究。因此，依赖少数表面蛋白的流式细胞术定义不同的Teff、Tmem和Tex细胞亚群是否真的能反应CD8 T细胞亚群的异质性仍有待确定。例如，具有相同染色质可及性特征的细胞可能具有不同的细胞激活状态以及表型异质性。甚至，一些Teff和Tmem细胞亚群与Tex细胞亚群具有相同的蛋白表达特征，如前体细胞相关的转录因子TCF1。因此，TCF1表达的细胞是否具有相同的潜在发育程序，以及不同发育途径中的CD8 T细胞是否依赖于TCF1转录回路仍有待研究。
为了解决这些问题，本研究基于LCMV病毒的急性和慢性感染模型，使用单细胞scRNA-seq和scATAC-seq测序技术纵向探究不同分化时间点的Teff，Tmem和Tex细胞。我们的数据解析了不同CD8 T细胞亚群的异质性特征，鉴定了主要CD8 T细胞分化发育途径的基因表达和染色质可及性模式。通过scATAC-seq和scRNA-seq数据的比较分析，我们发现具有不同转录状态的CD8 T细胞存在着相同的染色质可及性特征。我们的研究还发现了新的Teff、Tmem和Tex细胞亚群的子集，包括一群表达NK细胞相关基因的Tex细胞，它们具有免疫治疗响应的特征。此外，我们还发现了多群具有不同表观染色质可及性特征的TCF1表达细胞。同时，我们还发现慢性感染早期出现的Tex前体细胞和晚期的Tex前体细胞存在较大的差异，并且它们与急性感染中表达TCF1的Tmem前体细胞和成熟的Tmem细胞之间明显不同。最后，我们还确定了细胞应激调节因子 Btg1是Tex细胞分化的新型调控基因。总之，我们的研究构建了不同CD8 T细胞亚群的单细胞转录组和表观染色质可及性图谱，为探究Teff、Tmem和Tex细胞亚群分化发育的潜在分子调控机制提供了研究基础。
研究结果
不同分化状态的CD8 T细胞的转录组和表观组图谱
为了构建CD8 T细胞在不同分化发育途径中的转录组和表观组图谱，我们使用LCMV病毒急性感染模型（LCMV Armstrong，Arm）产生病毒特异性的Teff和Tmem细胞，使用LCMV病毒慢性感染模型（LCMV clone 13，C13）产生Tex细胞。我们将P14（TCR transgenic gp33-specific） CD8 T细胞过继转移到同源受体小鼠中，然后分别使用LCMV Arm和C13病毒进行急性和慢性感染，收集感染后第8，15和30天的P14细胞进行单细胞scRNA-seq和scATAC-seq测序分析。经数据预处理、质控过滤和降维聚类分群后，得到了CD8 T细胞在不同分化时间点的单细胞转录组和表观组图谱。可以看到，CD8 T细胞在急性感染（Arm）和慢性感染（C13）中不同时间点的细胞明显的区分开来，并且scATAC-seq数据区分不同时间点的细胞更清晰。除去初始CD8 T细胞（Tnai），我们将scRNA-seq数据聚类分群了18个cluster，将scATAC-seq数据聚类分群了16个cluster。其中，大多数cluster只包含了一种感染模式的特定时间点的细胞，少数cluster含有混杂时间的细胞。
接下来，我们想探究CD8 T细胞在不同分化发育途径的染色质可及性变化特征。我们查看了CD8 T细胞分化的3个关键基因：Tox，Pdcd1和Tcf7。其中，Tox是Tex细胞分化的一个关键转录因子，在慢性感染C13样本的不同时间点中它的表达水平都很高，同时scATAC-seq数据显示Tox基因位点的染色质可及性也在逐步增高。Pdcd1基因编码抑制性受体PD-1，在慢性感染C13样本中高表达并且有着特殊的染色质可及性特征，包括一个已报道的为Pdcd1基因TSS上游~23.8kb处的增强子元件。Tcf7在初始CD8 T细胞中高表达，并在随后的时间点中表达水平降低，该基因位点的染色质可及性在Tnai细胞中最高，在不同感染的其他时间点中它的染色质可及性有着复杂的特征。因此，我们可以鉴定出Teff、Tmem和Tex细胞亚群中关键基因的不同染色质可及性特征。
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Figure 1. Single cell transcriptional and accessible chromatin landscape of memory and exhausted CD8 T development
急性感染过程中CD8 T细胞基于细胞毒性潜力分化为两种主要的细胞类型
为了探究急性感染过程中Teff和Tmem细胞的分化发育轨迹，我们首先基于scRNA-seq数据鉴定了特定的细胞亚群。在d8样本中，我们鉴定到了3个细胞cluster：记忆前体细胞（MP）、效应T细胞（Eff）和细胞毒性T细胞（CTL），CTL细胞高表达Klrg1，Cx3cr1和细胞毒性基因，它们可能是KLRG1+CD127-的短寿效应T细胞（SLEC）的一个亚群。在d15样本中，我们也鉴定到了3个细胞cluster，分别命名为过度T细胞：Trans I，Trans II和Trans CTL。在d30样本中，主要鉴定了一个记忆T细胞亚群（Mem）。同样的，我们基于scATAC-seq数据进行细胞亚群的鉴定，我们使用基因的染色质可及性表示基因活性，根据不同的基因活性鉴定特定的细胞亚群。我们发现scATAC-seq数据鉴定到的细胞亚群和scRNA-seq鉴定的细胞亚群部分重叠，如d8 Eff和CTL细胞。但是，仍有一些细胞cluster只在scATAC-seq数据中鉴定出，包括Mem-CTL，表明染色质可及性可以提供细胞分化模式的额外特征。
通过基因活性分析，我们将scATAC-seq数据的8个cluster分成了两大类群：CTL和non-CTL，它们在细胞毒性基因如Gzma、Gzmb和Klrc1（NKG2A）处具有不同的染色质科技型特征。其中，CTL细胞类群主要包括d8样本的CTL，d15样本的Trans CTL I和Trans CTL II，以及d30样本的Mem-CTL细胞群，而non-CTL细胞类群包括d8样本的Eff和MP，d15样本的Trans Mem和d30样本的Mem细胞群。这两大细胞类群具有不同的染色质可及性特征，如Ccr7基因在non-CTL细胞类群中可及性较高，而Klrg1基因在CTL细胞类群中可及性较高。值得注意的是，尽管我们在scATAC-seq的d30样本中鉴定到了两群不同的记忆CD8 T细胞（Mem和Mem-CTL），但是在单细胞转录组数据中只鉴定到一个记忆CD8 T细胞群。总之，基于scATAC-seq数据，我们在急性感染模型中鉴定到了两大类具有不同表观遗传特征的细胞类群，它们分别具有细胞毒性和记忆性的特征。这种分支分化模式是在d8样本中出现的，与记忆和效应CD8 T细胞的早期命运分化决定观念相一致。
为了进一步探究这两大类具有不同表观遗传特征细胞类群的潜在转录调控因子，我们对CTL和non-CTL细胞类群的差异可及性peak进行转录因子TF motif的富集分析。结果发现一些TFs主要富集到特定的细胞cluster中，如AP1 motifs在Mem细胞cluster中富集，ZEB1, TCF3(E2A), TCF12(HEB)和SNAI motif主要富集到non-CTL细胞cluster中（包括Eff，MP，Trans Mem和Mem）。基于基因活性分析，我们发现转录因子Zeb1主要在non-CTL细胞类群中高表达，而Zeb2则在CTL细胞类群中高表达。TF motif富集分析结果也表明ZEB1 motif强烈地富集到non-CTL细胞类群中。这些结果与前期发现的Zeb1和Zeb2分别在记忆Tmem和效应Teff细胞形成和功能分化中的作用相一致。因此，我们的结果表明Zeb2在T细胞毒性功能形成中发挥着重要作用，并强调了Zeb2-Zeb2 转录因子对在急性感染模型中CD8 T细胞CTL和non-CTL细胞类群分支分化中的重要功能。
Mem-CTL（包括Trans CTL I和Trans CTL II）细胞类群可能是CTL效应细胞在病毒清除后残留的能持续存在的细胞群。为了验证这个猜想，我们检测更晚时期的CD8 T细胞中是否仍然存在Mem和Mem-CTL细胞类群。因此，我们收集了急性感染条件下d60和d200天的病毒特异性CD8 T细胞进行单细胞scATAC-seq测序分析。的确，在d60样本中，我们鉴定到了两种不同染色质可及性特征的细胞类群，将其命名为效应记忆EM和EM-CTL细胞。其中，EM-CTL细胞在细胞毒性相关基因如Gzma、Gzmb和NK细胞受体基因处的染色质可及性增强。同时，在d60样本中，我们还鉴定到了组织驻留记忆TRM和中央记忆CM细胞。然而，在d200样本中，我们只鉴定到了一群CM细胞（CM d200）和少量的TRM细胞。其中，d60和d200样本中的CM细胞聚类到不同的cluster中，表明记忆CD8 T细胞的染色质可及性特征随着时间的持续而不断变化。TF motif富集分析发现ZEB1 motif在CM和TRM细胞中显著富集，而在EM和EM-CTL细胞中几乎没有富集。这些结果表明，d30样本中存在的Mem-CTL细胞在持续一个月后的d60样本中仍然存在，而在d200样本中几乎检测不到。总之，我们的结果解析了急性感染条件下CD8 T细胞向记忆和效应T细胞分化的发育轨迹，表明长寿记忆CD8 T细胞的效应功能在急性感染的早期就已被表观遗传特征所决定。
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Figure 2. Acute-resolving infection generates two branches of effector and memory CD8 T cells distinguished by epigenetic cytolytic potential
单细胞转录组数据揭示Tex细胞亚群的转录异质性
不同于急性感染模型，CD8 T细胞在慢性感染或癌症中会诱导分化为耗竭Tex细胞，它们通常会高表达一些抑制性受体，并伴随着效应功能的减弱。目前，人们已经鉴定出了多种不同的Tex细胞亚群，包括耗竭前体细胞，中间过渡态耗竭细胞和终末分化的耗竭细胞。然而，耗竭Tex细胞的整体异质性特征仍缺少全面的了解。为了探究不同分化时间点中Tex细胞的发育途径和异质性特征，我们将慢性感染不同时间的CD8 T细胞进行单细胞scRNA-seq测序分析。在d8样本中，我们聚类分出了4个细胞cluster。其中一个细胞cluster包含效应样细胞（Eff-like），它有别于急性感染中的Eff细胞cluster。将Cl13 Eff-like和Arm Eff细胞cluster进行基因差异表达分析发现Tox，Lag3，Rgs16和Ifi27l2a基因在Cl13 Eff-like细胞cluster中高表达，而Klrg1，Ccr2和Selplg基因则在Arm Eff细胞cluster中高表达。代谢通路富集分析结果表明T细胞激活相关通路在Arm Eff细胞中富集，而病毒响应基因如I型干扰素响应相关通路在Cl13 Eff-like细胞中富集。同时，我们还发现了两群处于增殖状态的细胞cluster，大多数增殖的细胞分布在d8 Eff-like细胞cluster中。在d8 Cl13细胞群中，有一群耗竭前体Exh-Pre细胞，它与急性感染下的MP细胞具有相似的基因表达特征，如Il7r，Id3，Tcf7，Lef1，Sell和Ccr7。然而，该群细胞还高表达耗竭相关基因如Tox，Tox2，Pdcd1和Lag3，与前期研究发现的在慢性感染早期就存在耗竭命运决定的细胞群的结果相一致。
接下来，我们继续探究耗竭晚期时间点中Tex细胞群的异质性特征。我们在d15和d30样本中鉴定到了7个细胞cluster。其中，在这些时间点中有一群耗竭祖细胞Exh-Prog与d8的Exh-Pre细胞具有相似的转录特征，但是它也存在着自己独特的转录特征，如高表达Eomes和Fos基因。同时，我们还鉴定到了两群高表达热激活蛋白的Exh-HSP细胞群和干扰素响应基因（ISG），其他两群细胞高表达多种抑制性受体，类似于以前定义的终末耗竭Tex细胞。基于无监督聚类，终末耗竭Tex细胞分出了两个不同的细胞群Exh-term和Exh-TermGzma，后者高表达细胞毒性基因如Gzma。此外，我们还发现了一群以前未鉴定到的Tex细胞，它们高表达NK细胞相关基因，我们将其定义为Exh-KLR细胞。由于Exh-Int与Exh-KLR和Exh-HSP细胞cluster处在邻近的细胞群中，我们认为这些细胞类群可能都是处于中间过渡态Tex细胞。为了进一步探究新鉴定的Exh-KLR细胞亚群的转录特征，我们将Exh-KLR细胞和Exh-Int和Exh-Term细胞进行差异比较分析。结果发现Exh-KLR细胞亚群会高表达NK细胞相关基因（Klrs，Fcgr2b等），细胞毒性基因（Gzma和Gzmb），细胞迁移相关基因（S1pr5和Itgb7），以及一些转录因子（Zeb2，Klf2，Klf3和Id2）。这些结果表明Exh-KLR细胞群相比于其他Tex细胞亚群具有更强的细胞毒性潜能。近期有研究表明高表达NK细胞受体的CD8 T细胞具有临床免疫治疗潜能。
接下来，我们想知道这些Tex细胞亚群，包括Exh-KLR细胞，是否可以使用流式细胞术鉴定出。基于病毒特异性的P14 CD8 T细胞，在d8时间点，Exh-Pre和Eff-like细胞群可以通过LY108和TIM3蛋白区分出。在d15和d30时间点，可以使用分层画门的策略鉴定出主要的细胞群。其中，Exh-Prog细胞可以定义为LY108+CX3CR1-。在LY108-CX3CR1+细胞群里，Exh-KLR细胞可以通过KLRC1(NKG2A)和KLRD1(CD94)的表达区分开，而Exh-Int细胞定义为NKG2A-CD94-。在LY108-CX3CR1-细胞群里，Exh-Term和Exh-Termgzma细胞可以通过GZMA的表达进行区分开。与单细胞转录组表达数据相一致的是，Exh-Termgzma细胞也高表达CD244(2B4)蛋白。因此，基于细胞表面蛋白标记，我们可以清楚地区分出慢性感染中的不同Exh-Pre, Eff-like, Exh-Prog, Exh-Int, Exh-KLR, Exh-Term和 Exh-TermGzma细胞。同时，我们还发现这些细胞群的比例随着感染时间的推移而不断变化，特别是Exh-KLR细胞从d15到d30天间不断增加。在RNA水平，Exh-KLR细胞高表达一些NK细胞受体基因，包括KLRB1C(NK1.1)和KLRA9(Ly49l)。随着时间的推移，这些蛋白的表达逐渐增加。在d30天时，Exh-KLR细胞群存在一定的异质性，可以通过这些NK细胞受体蛋白的表达进行区分。NK细胞受体基因的表达不是慢性感染Cl13中特有的，急性感染Arm中的大多数CD8 T细胞在d8和d30天时也表达KLRC1和KLRD1，这与先前研究报道的在病毒和细菌感染的CD8 T细胞中也高表达NK细胞受体基因的结果相一致。鉴于它们都表达NK细胞受体基因和效应分子，我们接下来将慢性感染中的Exh-KLR细胞与急性感染中的CTL和Mem-CTL细胞进行差异分析。结果发现Exh-KLR细胞与这两群具有细胞毒性的细胞之间存在大量的差异表达基因DEGs，包括Tox，Bcl2和Lag3等，它们在Exh-KLR细胞中高表达。这些结果表明Exh-KLR细胞与急性感染中的Teff和Tmem细胞是不一样的。同时，这结果也表明了尽管慢性感染中的Exh-KLR细胞和急性感染中的CTL和Mem-CTL细胞有着不同的分化路径，但是它们之间共享了表达NK细胞受体相关基因的转录程序。
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Figure 3. Exhausted CD8 T cells are transcriptionally heterogenous including a distinct subset characterized by expression of NK receptors
单细胞表观组数据揭示4种不同的Tex细胞亚群
与Teff和Tmem细胞相比，耗竭Tex细胞具有独特的表观遗传发育特征，至少部分是由转录因子TOX驱动的。然而，这些Tex细胞群的表型和转录异质性与潜在的染色质景观的异质性之间的关系仍不太清楚。这是一个关键的问题，因为Tex细胞独特的表观遗传景观限制了细胞的可塑性和对免疫治疗方法的敏感性。为了解决这些问题，我们接下来想知道这些Tex细胞亚群是否在单细胞scATAC-seq数据中也存在。
对scATAC-seq数据进行聚类分群后，我们在慢性感染Cl13样本中鉴定到了8个不同的细胞cluster。进一步进行细胞类型的注释，在d8样本中我们鉴定到了3个细胞cluster：一个Exh-Pre和两个Eff-like细胞群。将Eff-like I和Eff-like II细胞群进行比较发现一些基因的染色质可及性向Eff-like II细胞中逐渐增强，如Ccr9，S1pr1和Cd69以及一些整合素基因，表明这些细胞可以迁移到外周组织中。在d15样本中，我们鉴定到了Exh-Prog细胞群，同时还鉴定到一大群过度细胞Exh-Trans。在d30 样本中，我们鉴定到了4个细胞群：Exh-Prog，Exh-Int，Exh-KLR和Exh-Term。为了了解这些表观特异性的细胞群是否与转录异质性的细胞群相一致，我们将scRNA-seq鉴定的细胞cluster与scATAC-seq的cluster进行相关性比较分析。结果发现scATAC-seq数据鉴定到的细胞cluster比scRNA-seq的cluster要少，其中在d8（3 clusters vs 7 clusters），d15（5 vs10）和d30（5 vs 11）。这些差异表明scATAC-seq鉴定到的少数细胞cluster可能具有多个不同的转录状态。
接下来，我们继续探究不同Tex细胞亚群的表观遗传特征。首先，我们在这些Tex细胞亚群中共鉴定到了20362个差异的染色质可及性区域（DACRs），并将这些DACRs注释到邻近的基因中。结果表明不同的Tex细胞亚群之间具有差异的和共享的ACRs。例如，Exh-Pre和Exh-Prog细胞群之间具有相似的DACRs图谱，包括干细胞性相关基因如Tcf7，Foxp1和Id3基因处的DACRs。Eff-like I和Eff-like II细胞群之间也共享了染色质可及性，如Ifng和Bhlhe40基因处的DACRs，这些与Exh-KLR细胞也是相似的。然而，Exh-KLR细胞还包含一些特有的DACRs如Rap1b，Id2和Klrb1c等。Exh-Term细胞表现出独特的ACR图谱，包括Fyn，Ptger4，Btg1和Rgs1基因。
我们接下来想知道是什么转录因子TF潜在调控了不同Tex细胞的转录程序。我们对不同Tex细胞的ACRs区域进行TF motif富集分析，正如所期望的一样，Exh-Pre和Exh-Prog细胞的ACRs区域显著富集到TCF1 motif。然而，Exh-Pre细胞中还富集到AP1 motif，表明它们响应着较强的TCR刺激，而Exh-Prog细胞中还富集到NFkB和RFX motif。Exh-Term细胞中富集到一些独特的TF motif，如ETV, ETS和Fli1等，在Exh-KLR和Exh-Int细胞群中富集到一些共享的TF motif，如KLF家族的转录因子。此外，我们还发现ZEB1 motif在Exh-KLR细胞中几乎不存在，而在其他Tex细胞中都有一定的富集，类似于急性感染中ZEB1不在CTL细胞群中富集。同时，我们还发现在Exh-KLR和CTL细胞群中都有着较强的Zeb2基因活性，而有着很低的Zeb1基因活性，表明他们之间共享了一些TF使用特征。尽管CTL和Exh-KLR细胞都有着较强的Zeb2基因活性，但是Exh-KLR细胞中还有着很强的Tox基因活性，这在急性感染的CTL细胞中是没有的。
为了进一步比较Exh-KLR和急性感染中的CTL细胞之间的表观遗传特征的差异，我们将CTL, Mem-CTL，和Exh-KLR细胞群各自特异的ACRs区域进行overlap重叠分析。结果发现相比于CTL和Mem-CTL细胞，Exh-KLR细胞的ACRs区域大多是其特异的（2123/2739）。实际上，Exh-KLR细胞与CTL和Mem-CTL细胞之间只共享了11%和3%的ACRs区域。Exh-KLR细胞特有的差异ACRs区域显著富集着KLF和AP1 motif，而CTL和Mem-CTL细胞中着主要富集着ETS, ETV和RUNX motif。因此，尽管Exh-KLR细胞群使用了类似急性感染中CTL细胞共有的细胞毒性和NK细胞相关基因的表观遗传和转录特征，但是它与CTL细胞之间仍然存在着巨大地差异，属于不同的细胞亚群。
总之，这些scATAC-seq数据揭示了不同Tex细胞亚群的染色质可及性景观，发现它们与Teff和Tmem细胞之间相似和差异的表观遗传特征，基于单细胞染色质数据鉴定到了4种主要的Tex细胞亚群：Exh-Prog, Exh-Int, Exh-KLR和Exh-Term。
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Figure 4. The accessible chromatin landscape of TEX evolves over time and distinguishes fewer epigenetic cell fates under wider transcriptional diversity
