【微生物文献】叶际微生物抑制病原微生物新机制

最近，杂交水稻全国重点实验室在Nature Communications发表了题为“Microbiome homeostasis on rice leaves is regulated by a precursor molecule of lignin biosynthesis”的论文。该研究发现水稻借助其木质素前体合成基因OsPAL02 合成4-HCA实现叶际微生物有益群体的定向原位募集与稳态构建，率先从分子水平解答了植物叶际微生物群落组装与植物遗传、代谢调控的关系。

Microbiome homeostasis on rice leaves is regulated by a precursor molecule of lignin biosynthesis

======实验设计=====

1. 重测序

挑选了110个水稻的品种，进行了重测序，每个三个重复。这110个水稻品种可以分为：japonica（热带粳稻27个、温带粳稻7个，和2个混合的粳稻）和indica【籼稻】（32个indica, 22 aus, 2 admixed indica），具体信息如下表所示。

附表1

2. 微生物测序

对于上述的110份水稻品种, 取抽穗期（booting stage）的水稻叶片，进行细菌的测序（看起来貌似只测了16S）。

=========实验结果========

1. 水稻叶际微生物特异性的依赖于基因型

首先利用国际水稻所（IRRI）建立的多样性群体Rice Diversity Panel II (C-RDP-II)中的110个代表性品种完成了迄今最全面的水稻叶际微生物组物种水平组装解析（Su, et.al., Scientific Data, 2022）。但是文章好像只有细菌，没有真菌的数据，但是作者好像笼统的都称为微生物了。

分析揭示，不同细菌的丰度在不同的分类学水平上均呈现籼/粳稻差异（图1A），alpha多样性也显示在籼/粳稻之间呈现显著的差异(图1B)，籼稻比粳稻差异性更大。该差异在优势物种间（目水平）尤为显著，预示水稻遗传变异驱动叶际微生物组特异性组装（图1C）。籼稻和粳稻的优势菌目由假单胞菌组成（57%和72%的相对分别为籼稻和粳稻的丰度），其次是肠杆菌类
（19%和7%），鞘氨醇单胞菌（5%和5%），伯克霍尔德菌黄单胞菌目（1.8%和3.5%），黄杆菌目（3.4%和1.1%）、根霉菌目（1.5%和1.3%）、考氏菌目（1.3%和1.7%）和芽孢杆菌（1.7%和0.8%）（图1c）。与粳稻相比，籼稻品种的相对丰度更高肠杆菌属、黄杆菌属和伯克霍尔德菌属，而粳稻品种的假单胞菌相对丰度较高和黄单酵母。

有趣的是，46个肠杆菌属（占已鉴定总数的92%），17个伯克霍尔德菌属（占总数的27.4%）和5个来自Pseudomonadales的属（占总数的83%）在籼稻和粳稻品种中中显著差异（附图4）。相比之下，Aerosticca属只有黄单菌目和黄杆菌目中的Chrysobacterium属在籼稻和粳稻之间有显著的差异。因此，说明水稻品种的差异可能影响了叶际微生物的形成。

图1：Phyllosphere microbiome comparisons of indica and japonica rice varieties. 附图4

2. 水稻叶际微生物组与代谢途径的关联

然后作者利用近7,000个物种丰度的表型数据与近20,000个水稻SNP位点进行遗传关联（GWAS），获得496个与水稻2,667个SNPs存在关联的优势物种(图2c)。作者发现大多数GWAS关联到的物种属于假单胞菌（129个位点相关，占30.24%），伯克霍尔德菌（100个位点，占21.37%），黄单胞菌目（47个相关位点，占8.87%）和肠杆菌属（76个相关位点，占8.67%）（图2a）。使用Bray-Curtis对于这496物种聚类结果表明，可以分为四个簇：簇1（与Pseudomonadales相关），簇2（与伯克霍尔德菌相关），簇3（包含与肠杆菌属相关）和簇4（与Xanthomonadales相关）（图2a）。这些关联表明，四种细菌的成员对某些寄主植物的遗传背景特别敏感。

为了进一步阐明宿主遗传变异如何影响叶际微生物组，特别这些高度特异的细菌。对于关联的SNP位点相关的基因进行了GO和pathway的富集分析。结果发现代谢途径（dosa01100）和代谢过程（GO:0019748）显著富集。并且对于4个不同cluster中关联的SNP位点富集到特异的一些代谢通路（图2b）。例如，与肠杆菌相关的基因显著富集蛋白酶组（dosa03050），赖氨酸降解（dosa0310），氨基酸的生物合成（dosa01230），泛素介导的蛋白水解（dosa04120），SNARE在膀胱中的相互作用运输（dosa04130）、半胱氨酸和蛋氨酸代谢（dosa0270），磷脂酰肌醇信号系统（dosa04070），以及谷胱甘肽代谢（dosa00480）途径等。类似滴，Burkholderiales相关的基因则显著富含戊糖和葡萄糖醛酸相互转化（dosa0040）、蛋白质出口（dosa03060），苯丙氨酸代谢（dosa0360）与精氨酸和脯氨酸代谢（dosa0030）途径。假单胞菌相关基因在植物与病原体的相互作用中显著富集（dosa04626），Stilbenoid，二芳基庚烷和姜酚生物合成（dosa0945），植物激素信号转导（dosa04075），醚脂质代谢（dosa0565），甘油磷脂代谢（dosa0564）、MAPK信号通路植物（dosa04016）和泛醌和其他萜类醌生物合成（dosa00130）路径。与黄单胞菌相关的基因在玉米素生物合成（dosa09008）与氨基糖和核苷酸
糖代谢（dosa0520）中富集。值得注意的是，不同的细菌种类之间富集的也有相同的代谢途径。例如，肠杆菌-和与假单胞菌相关的基因都富含硫代谢途径（dosa0920），而伯克霍尔德菌-，假单胞菌-与黄单胞菌相关的基因都富集到苯丙烷生物合成途径中（dosa0940）。
这些结果都为理解宿主代谢途径和叶际微生物的调控提供了关键见解。由于苯丙烷生物合成途径与三个主要的细菌有关，作者猜测该途径可能在宿主微生物调控方面发挥关键作用。

因此，作者进一步查看了伯克霍尔德菌、假单胞菌-和黄单酵母在苯丙烷生物合成途径中相关的基因（图2c，d）。我们发现大多数prx（过氧化物酶）基因参与木质素生物合成，与伯克霍尔德菌、假单胞菌和黄单藻目显著相关（图2d）。此外，4CL1和C4H2与伯克霍尔德菌特异性相关。另外，OsPAL02、OsCAD4和OsCCR21基因，与Pseudomonadales特异性关联。

图2：GWAS with rice phyllosphere microbiome.

总的来说，寄主的遗传差异可能调控了叶际微生物组。作者结果表明木质素合成相关的微生物可能参与了微生物群体的组装，并且某些特定的微生物可能调控特定的细菌种类。

3. 驱动微生物组装相关基因的鉴定

由于假单胞菌通常是叶际微生物的重要成员，我们试图去解析它的富集。假单胞菌不仅在水稻叶际相对丰度较高，并且关联的SNP位点中也占比比较大，说明与宿主植物遗传背景高度相关。为了验证他们之间的关系，作者选择了其中一个关联位点OsPAL02，因为它与Pseudomonadales有很强的相关性，并且也没有直系同源基因和关联的其他细菌。对于OsPAL02基因突变体缺乏苯丙氨酸/酪氨酸氨裂解酶,16S结果表明Pseudomonadales的丰度明显降低（图3a）。

为了进一步研究OsPAL02在水稻叶际微生物中的调控作用，作者对于野生型（WT），OsPAL02突变体（OsPAL02-KO），OsPAL02过表达（OsPAL02-OE）材料，进行了16S 测序。在温室条件下，作者发现叶际中的群落结构在WT，OsPAL02-OE和OsPAL02 KO中占主导地位的是假单胞菌属、肠杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和黄单胞菌目，黄杆菌目、帕尼菌目、根霉菌目、鞘氨醇杆菌目等（图3a），这和前面分析的叶际微生物群落构成是一致的。PCA结果表明这3个材料也具有明显的差异（图3b）。从丰度上看，Pseudomonadale在敲除材料中明显下降，在OE材料中明显上升（图3c）。但是Xathomonadales则在敲除材料中明显上升（图3d）。

图3：OsPAL02 is linked to phyllosphere microbiome assembly and has implications for plant health.

在苯丙烷生物合成途径中，基因OsPAL02编码一种苯丙氨酸/酪氨酸氨裂解酶，对L-酪氨酸转化为4-羟基肉桂酸（4-HCA）以及L-苯丙氨酸转化为反式肉桂酸，它们都是木质素生物合成的前体。因此，作者推测OsPAL02的产物对叶际微生物有选择性的招募，尤其是假单胞菌目的细菌。因此，作者对WT、OsPAL02-OE和OsPAL02 KO的水稻叶片进行了代谢组分析，以便确定OsPAL02的差异。结果表明：这2个材料之间的代谢组数据可以分成3个cluster，并且证实了OsPAL02参与了肉桂酸及其衍生物的生物合成（图4a）。基于代谢组数据的PCA结果也表明WT、OsPAL02-OE和OsPAL02 KO3个材料可以明显分开（图4b）。3个材料之间共鉴定到12个显著差异的代谢物。其中4-HCA在OE材料中明显上升，在敲除材料中明显下降（图4c），说明4-HCA可能是受OsPAL02调控的，进而影响了叶际微生物的组装。挑选的几个籼稻和粳稻材料的代谢检测也表明4-HCA在籼稻和粳稻之间显著差异（附图12）。这些结果都说明4-HCA可能受到OsPAL02，进而调控了籼稻和粳稻之间叶际微生物的差异。

图4：Metabolite profiles of OsPAL02 mutants. 附图12

除了改变的叶际微生物之外，OsPAL02 KO与WT和OsPAL02-OE材料相比，还更易干冰，出现了严重的疾病症状（图3e），并且在敲除材料中鲜重明显偏低（图3f）。为了确认敲除材料的疾病症状是不是由于微生物群落的改变引起的，作者在无菌条件下种植WT和敲除植株。结果发现敲除植株和WT之间鲜重等并无差异（附图14）。这一观察结果表明OsPAL02 KO的疾病症状可能是由微生物群引起的生态失调。结合代谢物分析结果和上述分析，作者提出OsPAL02可能负责产生4-HCA并维持功能性微生物群落的稳定。

附图14

为了验证4-HCA的作用，OsPAL02-KO的水稻叶片用4-HCA喷洒植物。正如所预期的，喷屎4-HCA的OsPAL02 KO植物与野生型植物的鲜重没有显著差异（附图15）。从而真实了4-HCA的作用。

附图15

4. 4-HCA和假单胞菌成员对叶际微生物稳态的调控

尽管我们观察到4-HCA与叶际微生物的组装相关，但是其背后机制尚不清楚。为了探索4-HCA背后的机制，作者还从WT，敲除和OE材料中分离了相关的细菌。最后总共获得了77株，14种细菌（附图16）。主要是伪单胞菌（占22.08%）、芽孢杆菌（19.48%）、肠杆菌（15.58%），鞘氨醇单菌门（9.1%）和黄杆菌门（7.79%）。

附图16

由于观察到的疾病症状不仅在OsPAL02 KO中有，而且在一些WT和OsPAL02-OE中也有（图3e），作者猜测病原菌可能存在分离的群体中。经分离鉴定，获得了可能的病原菌：Xanthomonas oryzae strain TJ1 (hereafter referred to as TJ1)。TJ1侵染后，水稻的鲜重明显降低（附图17）。

附图17

接种TJ1后，水稻叶片观察到了非常明显的染病症状（附图17）。有趣的是，如果暴露于各种微生物后，这种表型就消失了。所以，我们推测4-HCA的作用应该是部分依赖于微生物群落的稳态的（图3e，3f）。所以作者用加4-HCA和不加4-HCA测试了和分离的各种细菌共培养的结果（图5a）。结果表明在1mM 4-HCA条件下，所有的假单胞菌，包括不动杆菌21，都强烈的抑制了病原菌TJ1。相反的，当不加4-HCA的时候，75%的假单胞菌菌株失去了抑制病原菌的能力（图5a）。而伯克霍尔德家族，只有Delftia sp.12在加4-HCA的时候抑制TJ1，不加4-HCA的时候失去抑制的特性。

图5：Effects of 4-HCA on phyllosphere bacterial growth and rice pathogen TJ1.

总的来说，4-HCA的抑制作用依赖于假单胞菌菌株的存在，说明4-HCA在叶际微生物中起着枢纽的作用。所以作者设计了一个包含假单胞菌的合成群落，然后测定它们对于TJ1的抗性。10mM的MgCl2处理后，WT、OsPAL02-KO和OsPAL02-OE植株之间并没有明显的表型（图6a，6b）。这说明合成群落没有明显的阴性。然后用TJ1侵染的植株，并且用合成群落处理TJ1侵染的植株。对于WT和OE植株，合成群落对于TJ1侵染的植株都有明显的抗性（图6c，6d）。相反，敲除植株没有相关的抗性。当TJ1侵染的时候，相比OE植株，WT和敲除植株都有明显的感病性（图6e，6f）。说明没有合成群落的话，植株对于TJ1的抗性将会消失。

图6：SynCom inhibits TJ1 under 4-HCA presence in vivo.