【文献分享】橡胶树单细胞应答白粉病早期侵染
今天分享一篇，最近发在《Plant Cell and Environment》的通过单细胞来揭示橡胶树应答白粉病早期侵染的文章：“Single-cell transcriptomic analyses reveal cellular and molecular patterns of rubber tree response to early powdery mildew infection”。
========实验设计============
还是先看实验设计：选取的是1年的橡胶树的seedling，大概20个枝。然后其中一枝接种白粉病病原菌，一枝作为control。然后分别在8小时和36小时收集WT以及接种病原菌的叶子，相当于总共4个样。
======实验结果========
有一说一，这个文章的结果写的可真是多啊，写了9个results，其实有的结果是可以直接合并的，不重要的可以不用highlight，越多显得越没有重点。
1. 原生质体的制备以及单细胞测序
根据上述的实验设计进行取样，共4个样品：C8, C36，T8, T36（其中前2个是control），制备了原生质体。通过单细胞测序获得了44,102个cell。其中每个cell的平均表达基因是3756个。
2.叶片细胞图谱构建
然后就是经典的单细胞数据的聚类，细胞类型注释了，总共可以分成18个cluster（下图b）。然后依据其它物种的marker基因在橡胶树里的同源基因（下图c），把这18cluster进行了注释程了10个不同的细胞类型（下图d）。
3. cell cluster identification（不知道咋翻译好，算是细胞簇的鉴定和验证吧）
然后作者对10个细胞类型进行了GO富集分析（下图a）。然后作者又手动分离了一些叶片上的常见小组织：表皮，叶肉细胞，维管束，latex。挑了几个marker基因分别做了PCR进行了验证（下图b）（其实可以和别的paper一样，原位杂交，或者GUS染色的方法）。
4. 白粉病侵染后单细胞level的变化
然后对比了control和处理样品的差异，比如不同细胞类型的比例，total UMI，差异基因在不同细胞类型中的分布等。作者发现在表皮和分生细胞类型上差异比较显著（下图a）。在表皮细胞上有个明显上升的趋势，而在叶肉细胞上有明显下降的趋势（下图b）。【但是个人觉得，缺点是，没有统计检验，我自己无法在不同的细胞类型之间进行显著性的比较】。差异基因的分布显示在meristem细胞类型和hydathode细胞类型差异基因较多，并且虽然不同细胞类型之间有overlap的差异基因（下图d），但是更多的是细胞类型特异响应的（下图e）。
5. 白粉病在不同细胞类型响应基因的功能特征
简单的说，就是result 4里面鉴定的差异基因做了个GO和KEGG富集分析（下图a/b），完全可以和上面合在一起的。从富集功能层面阐述了白粉病响应的基因。
6. 白粉病响应过程中的表皮细胞的进化轨迹分析
以前结果表明这类病害主要侵袭叶片的表皮细胞，在其中形成一些特殊的结构并传递效应子来抑制植物的免疫反应。所以作者单独把表皮细胞拿出来做了轨迹分析（下图a）。从轨迹图可以看出，整个轨迹可以分成7个不同的states（下图b）。然后作者鉴定了分支上起着关键分化作用的节点（下图c），然后发现大部分基因都是植物病原菌互作相关的，并且这类基因可以大致分为4大类：NLR相关，calcium sensors, NADPH和WRKY转录因子。（也不知道依据什么逻辑分成的4类）。同时作者发现其中一个NLR基因，是CNL家族的，推测可能在抗白粉病中起着关键的作用（也开始讲他们那个基因，但是逻辑上过渡的还是牵强，是在单细胞中非常特异响应还是在top list，也没看这个基因具体的在单细胞中的pattern；可能是这个基因在实验室已经有了积累，所以合起来讲的故事）。
7. HbCNL2基因的表达规律以及进化分析
作者对CNL家族进行了全基因组鉴定，共鉴定出43个CNL基因。其中6个和barley以及Dasypyrum的最接近，命名为了CNL1/2/3/4/5/6（下图a），其中CNL4就是上面轨迹分析中highlight的。接着作者查看了在不同品种（高抗，抗，感，高感）中这6个CNL的表达值，发现这6个CNL在抗性品种的表达值显著高于感性品种（下图b）。然后作者克隆了CNL2）（铺垫了那么多CNL4，这里确讲了CNL2，逻辑上好像有点突兀。当然一定程度也说明实验室积累的重要性，不要为了纯粹做一个单细胞而去做单细胞），并且做了不同组织以及病原菌处理不同时间点的表达值（下图c/d）。
8. CNL2的亚细胞定位和功能分析
CNL2的亚细胞定位显示CNL2位于cytomembrane上而不是核上（下图a）。在CNL2的侵染区域表现出细胞死亡的表型（下图b/c）。过表达CNL2后，ROS level明显升高。
9. CNL2和chaperones蛋白互作
最后作者利用LCA和BiFC验证了CNL2和HSP90互作，但是和SGT1b不互作（下图a/b）。进一步的发现CNL2中的LRR domain和HSP90中的HATPase domain互作（下图c）。
