生信+体外实验综合分析强调PRDX在HNSCC中的潜在作用，有望
Comprehensive Analysis of the PRDXs Family in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
头颈部鳞状细胞癌中PRDXs家族的综合分析
发表期刊：Front Oncol
发表日期：2022 Mar 8
DOI: 10.3389/fonc.2022.798483
期刊相关信息
一、背景
头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是第六大最常见的肿瘤，每年在世界范围内约有83万新病例和43万死亡病例。
过氧化物酶 (PRDX) 家族的过氧化物酶包括六个成员（PRDX1 至 PRDX6），构成了广泛的细胞抗氧化卫士。根据半胱氨酸的数量，PRDXs被分为三类：典型的2-半胱氨酸过氧化物酶（PRDX1-PRDX4），非典型的2-半胱氨酸过氧化物酶（PRDX5）和1-半胱氨酸过氧化物酶（PRDX6）。PRDXs催化H2O2，过氧亚硝酸盐和有机氢过氧化物的还原，以维持活性氧（ROS）的细胞内平衡。ROS失衡与肿瘤发生和进展密切相关。适度的ROS产生刺激细胞增殖和分化，然而过量的ROS诱导蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤，并最终导致细胞结构损伤和死亡。
根据最近的报道，PRDX家族在多种肿瘤中出现失调。PRDX6在线粒体功能障碍和铁死亡中起着至关重要的作用。然而，PRDX在HNSCC发生和进展中的作用尚未阐明。
二、材料与方法
1.数据来源
1）来自癌症基因组图谱数据库（TCGA）的 HNSCC数据集的三级RNASeq、miRNASeq数据和相应的临床信息
2） 单细胞转录组队列：GSE103322
2.实验流程
1） 基因组变异分析和功能状态特征：根据 "survminer "R软件包将TCGA HNSCC队列分为不同的组（PRDXs-高和PRDXs-低）；使用"GSVA "R软件包进行了基因组变异分析（GSVA）；CancerSEA用于评估PRAXs和基于GSE103322数据集的14种功能状态之间的关系
2） 肿瘤免疫学分析：ESTIMATE算法获得了肿瘤的纯度；使用基于23种免疫细胞特征的单样本基因集富集分析（ssGSEA）来量化免疫细胞的浸润；在不同的PRDX组中也评估了免疫相关分子的差异。
3） HNSCC中PRDX的甲基化、拷贝数变异和lncRNA分析：基于MEXPRESS对HNSCC数据集中PRDXs的甲基化和拷贝数变异（CNV）进行了评估和可视化
4） 免疫治疗反应预测：根据亚类图谱评估了PRDX1/5/6和免疫治疗的黑色素瘤患者之间基因表达谱的相似性
5） 细胞转染、定量实时PCR、蛋白质印迹法、细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测、菌落形成试验、伤口愈合试验、转孔试验、细胞凋亡试验、线粒体ROS（mtROS）测量
三、实验结果
01 - PRDX4和PRDX5的高表达可预测HNSCC的预后
作者分析了TCGA数据库中HNSCC和正常对照之间的PRDXs（PRDX1-6）的表达水平。与正常组织相比，PRDX1、PRDX4和PRDX5明显上调，而PRDX2在HNSCC肿瘤中明显下调（图1A），在配对的HNSCC和正常组织中也发现类似的结果（图1B）。K-M生存分析表明，较高的PRDX3、PRDX4、PRDX5和PRDX6表达水平与预后不良相关（图1C）。此外，发现PRDX3/4/5/6可能是HNSCC生存的一个独立风险因素，PRDX3/4/5/6高表达的死亡率明显较高。
图1 PRDXs在HNSCC中的表达和预后
02 - 基因组变异分析和功能状态特征
进行GSVA分析以探索PRAXs在HNSCC患者中的可能作用。PRDX1、PRDX5和PRDX6与DNA修复、MYC靶点V1/V2、mTORC1信号传导、氧化磷酸化和脂肪酸代谢呈正相关。相似的是，PRDX1、PRDX5和PRDX6与血红素代谢、KRAS信号传导上升、IL6_JAK_STAT3信号传导、补体、干扰素γ反应和炎症反应呈负相关。PRDX2和PRDX3与E2F靶标、G2M检查点和精子生成呈正相关。PRDX3和PRDX4与血红素代谢、雌激素反应、P53途径和胆固醇稳态呈负相关（图2A）。
接下来，根据CancerSEA数据库，使用单细胞转录组队列（GSE103322）来评估PRDXs与HNSCC肿瘤细胞的14个功能状态特征之间的关系。PRDX1与细胞周期、DNA修复和干性呈正相关，与血管生成、细胞凋亡、分化、DNA损伤、EMT、缺氧、炎症、侵袭、转移、增殖和静止呈负相关。PRDX2与血管生成、细胞周期、分化、DNA损伤、DNA修复、EMT、缺氧、侵袭、转移、增殖和静止呈正相关，而与干性呈负相关。PRDX3与细胞凋亡、细胞周期、分化、DNA损伤、DNA修复、侵袭、转移、增殖和干性呈正相关，而与血管生成、炎症和静态呈负相关。PRDX4与血管生成、细胞周期、DNA损伤、DNA修复、EMT、缺氧、侵袭、转移和增殖呈正相关，而与炎症和干性呈负相关。PRDX5与血管生成、细胞凋亡、分化、EMT、缺氧、炎症、侵袭和转移呈正相关，而与细胞周期、DNA损伤、DNA修复和干性呈负相关。PRDX6与细胞周期、DNA损伤和DNA修复呈正相关，而与血管生成、细胞凋亡、分化、EMT、缺氧、炎症、侵袭和转移、静止和干性呈负相关（图2B）。
图2 PRDXs在HNSCC中的功能分析
03 - 免疫微环境和PRDXs之间的关系
考虑到这些PRDXs都与免疫相关的途径有关，作者分析了免疫微环境和PRDXs之间的关系。PRDX1/5/6低表达的患者比PRDX1/5/6高表达的患者显示出更高的基质和免疫分数（图3A，B）。PRDX2-低的患者获得了更多的基质得分，而在PRDX2-低的患者中没有观察到更高的免疫得分。因此，进一步探讨了PRDX1/5/6-低和PRDX1/56-高之间肿瘤微环境的差异。与PRDX1/5/6-低组较高的免疫分数相一致，发现PRDX1/5/6-低组的免疫细胞浸润增加（图3C-E）。此外，许多免疫相关的基因在PRDX1/5-低组患者中上调，包括MHC-II分子（HLA-DRB5, HLA-DPB1, HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB2, HLA-DPA1和HLA-DQB1）、细胞毒性效应物（GZMB、GZMH和GZMK）、细胞因子（CXCL9、IFNG和IL10）和免疫检查点（BTLA、CD226、CD27、CD274、CD28、CTLA4、HAVCR2、ICOS、LAG3、PDCD1、TIGIT、TNFRSF9和TNFSF18）（图4A-I）。
图3 PRDX1/5低组的免疫细胞浸润更高
图4 在PRDX1/5低的患者中，免疫相关分子的表达水平有所增加
04 - HNSCC中PRDX的甲基化、CNV和lncRNA分析
为了探索HNSCC中PRDXs的表达调节机制，作者评估了PRDXs与甲基化、CNV和lncRNA之间的关系。PRDX1与9个甲基化探针呈负相关。PRDX2与甲基化显示出相对较强的相关性。PRDX3与甲基化探针呈正向或负向关联。PRDX5与4个甲基化探针呈负相关。PRDX6也与甲基化呈负相关。只有一个甲基化探针与PRDX4呈正相关。PRDXs的表达与CNV明显相关，特别是PRDX6和PRDX5（图5A）。此外，lncRNA和PRDXs之间的相关性见图5B。
图5 HNSCC中PRDX的甲基化、CNV和lncRNA分析
05 - PRDX1/PRDX5低水平的患者对免疫疗法更敏感
由于PRDX1/5/6与免疫评分之间存在负相关，作者进一步探讨了不同的PRDX1/5/6表达对免疫治疗的反应。结果表明，PRDX1/5-低表达的患者更有可能对抗PD-1产生反应（图6）。
图6 PRDX1/5/6的免疫治疗反应
06 - 沉默PRDX5抑制HNSCC细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡
据报道，PRDX4可促进口腔鳞状细胞癌的进展；然而，PRDX5在HNSCC中的生物学作用尚不清楚。首先，作者比较了PRDX5在人类正常上皮细胞系（NOK）和HNSCC细胞系中的mRNA水平，qPCR证实PRDX5在多个HNSCC细胞系中上调（图7A）。为了详细说明PRDX5的生物学功能，在HSC4和HN6细胞系中使用siRNAs敲除了PRDX5（图7B，C）。使用CCK8和菌落形成实验来测试PRDX5对HNSCC增殖的影响。在HSC4和HN6细胞中沉默PRDX5会降低细胞活力和菌落数量（图7D，E）。伤口愈合试验显示，沉默PRDX5显著降低细胞迁移（图7F）。转孔侵袭实验显示，siRNA组通过Matrigel膜的细胞数低于NC组（图7G），表明侵袭减少。同时，PRDX5的敲除引起了HNSCC细胞的凋亡（图7H）。此外，沉默PRDX5会增加HNSCC细胞的mtROS水平（图7I）。因此，这些结果表明，PRDX5可以通过其抗氧化特性促进HNSCC的进展。
图7 PRDX5敲除对HNSCC细胞在体外的生物学行为的影响QIKANXIANGGAUNXIN
四、结论
本研究探讨了PRDX在HNSCC中的价值。发现PRDX1、PRDX4和PRDX5在HNSCC中的表达增加，而PRDX2的表达降低。此外，PRDX4/5/6的高表达表明预后不良。PRDX1/5表达较低与免疫细胞浸润更多、免疫相关分子表达较高以及对抗PD-1治疗的更可能反应有关。此外，PRDX5敲低抑制HNSCC细胞增殖，入侵和转移，并可能通过其抗氧化特性促进细胞凋亡。综上所述，研究强调了PRDX在HNSCC中的潜在作用。PRDX5在HNSCC发育和免疫微环境形成中的功能使其成为一个有前途的潜在治疗靶点。
