酵母单细胞转录组测序：揭示霉酚酸和鸟嘌呤对mRNA表达水平的影响

文献下载链接： A yeast-optimized single-cell transcriptomics platform elucidates how mycophenolic acid and guanine alter global mRNA levels
发表期刊：《Communications Biology》
影响因子：6.5
时间：2021年

1. 酵母单细胞测序原理

实验原理图

实验方法

• 推荐细胞上样浓度： 50 cells/ul
• 细胞壁裂解的方法： 藤黄节杆菌酶（一种细胞壁消化酶，它不会改变RNA的稳定性或折叠结构）+SDS

• 30摄氏度 30min用于细胞裂解

  
  裂解液配方

2. 方案设计

方案背景：
MPA（霉酚酸）是一种延长寿命的化合物，可以减少de novo-GMP的合成，具体的生化途径已知如下，IMP-->XMP-->GMP-->GDP
（1）IMP-->XMP：IMP脱氢酶（IMD）催化肌苷5‘-磷酸(IMP)生成5’-磷酸黄嘌呤(XMP)
（2）XMP-->GMP：GMP合成酶（Gua1）催化5’-磷酸黄嘌呤(XMP)生成GMP。
（3）GMP-->GDP：鸟苷酸激酶（Guk1）催化GMP转化为GDP。
尽管了解 MPA 通过抑制 IMP脱氢酶(IMD) 来减少 GMP 合成，但它如何影响GMP/GDP/GTP合成下游的单细胞转录组尚不清楚
在作者之前的研究中，就已经发现：霉酚酸(MPA)通过抑制GMP合成延长酵母的寿命，而这一效应可以被外源性补充的 鸟嘌呤 抑制。

设置1个对照组和3个实验组，酵母细胞在以下条件均培养18h

• 对照组：DMSO (D=233个细胞；619 gene/cell)
• 实验组1：MPA (M=85个细胞；554 gene/cell)
• 实验组2：Guanine (G=258个细胞；443 gene/cell)
• 实验组3：MPA + Guanine (MG=268个细胞；578 gene/cell)

Illumina HiSeq2500：PE100测序

3. 结果分析

3.1 数据质控

3.1.1 双细胞率分析

作者使用以下5种算法计算双细胞率：DoubletFinder, Scrublet, DoubletDecon,scds, solo。
这些方法首先基于原始数据集，引入人工双胞模型，然后构建一个分类器来区分单胞和双胞。接着，这些方法为来自原始数据集的每个barcode提供了一个排序或分数，最终通过定义阈值来识别双胞。

DoubletDecon预测得到的双胞率高达53%（作者认为它有假阳性），而其他4种算法双胞率较低(~2–7%)

PCA点图：黑色表示双胞；灰色表示单胞
保守的双胞：被≥2种算法预测到的双胞
总计检出844个细胞（1个对照组+3个实验组），其中保守的双胞数量只有12个（双胞率2%）
作者认为这种方法的双胞率足够低，因为在哺乳动物的drop-seq实验中：50 cells/ul : 双胞率~ 5%; 100 cells/ul : 双胞率~ 11.3%
图B upset plot：用来查找被多个算法预测到的双胞数量。水平条形图（蓝色）表示在相应的工具中预测的双胞的数量。交集的大小表示在相应工具中预测的相同双胞的数量，对于由多个工具找到的双胞（称为保守的双胞），相应的条形图用黄色突出显示 图C PCA图：将图B中获得的“保守的双胞”在该图中以黄色的点展示

3.1.2 测序reads、转录本和基因计数的特征

有效reads占比：49.3% ~ 65.7%
捕获细胞数量： 85 ~ 268
平均转录本数量/cell： 840.19 ~ 1335.62
平均gene数量/cell： 443 ~ 578
酵母检出gene占比/sample：38.6% (M), 46.5% (G),55.7% (D), and 62.2% (MG)（酵母基因组总计6275个gene）
作者分析了过滤后的测序reads，以获得其GC含量和reads长度的条件特异性分布。

• 在四种生长条件下，所有有效细胞中的有效reads的GC含量分布均在23%左右

  
  4个样品中GC含量的百分比图：每条reads的GC数量占总reads长度百分比

• 在四种生长条件下，所有有效细胞中的有效reads的长度都一致地对应于52-53bp

  
  4个样本的总序列长度

• UMI计数的分布图显示，UMI的分布并不会随着转录本长度和GC百分比变化产生偏倚。

  
  箱形图：显示了中位数（中心线）、四分位数范围（铰链）和四分位数范围（须）；超出此范围的异常数据被绘制成单个点。

• 通过CV值度量转录噪声：低转录本数的基因与高CV值相关

  
  平均转录本数-变异系数的曲线图：平均值计算为相应样本(Dn=233、Gn=258、Mn=85、MGn=268细胞)中各基因的平均表达量。蓝线由 ggplot2的geom_smooth()函数二次多项式拟合(formula = y~poly(x, 2)

3.2 数据挖掘

3.2.1 等基因酵母群体显示出不同的转录组亚结构

作者将4个样本的数据合并（使用Seurat v3的merge 函数），同时将4个样本的矩阵数据标准化。通过降维分析可视化作图如下，可以看到不同组之间存在不同的转录特征。

4个样本(Dn=233，Gn=258，Mn=85，MGn=268细胞)的UMAP图
4个样本对应的差异基因表达的热图：颜色代表细胞在对应基因的标准化表达水平（黄色：表达水平高）

为了获得与数据对应的最佳定量聚类结果，作者进行单细胞共识聚类（SC3）得到如下图

单细胞共识聚类(SC3)方法：在4个样本的合并数据中识别出4个聚类

正如预期的那样，由于观察到的低群体异质性，几乎所有经过MPA处理的细胞都被映射到一个单一的SC3簇(SC3_4 3)。另一方面，大多数用DMSO或鸟嘌呤处理过的细胞被映射到3个或4个SC3簇中。

桑基图：4个样本映射到SC3的4个cluster (cluster 1n=331，cluster 2n=193，cluster 3n=164，cluster 4n=156细胞)。

为了定量评估与每种处理条件相关的亚群，作者分别对每个处理组特异性基因表达矩阵进行了SC3聚类分析。

• Control：DMSO区分出两个cluster（177；56）
• Guanine-treated：鸟嘌呤处理组区分出2个cluster（135；123）
• MPA-treated：SC3无法区分亚群
• MPA+Guanine-treated：鸟嘌呤+MPA处理组区分出3个cluster（166；77；25）

DMSO：k=2可以合理地分辨出包含177和56个细胞的2个亚簇
鸟嘌呤：合理地分辨出包含135和123个细胞的2个亚簇
MPA：由于明显缺乏异质性，SC3无法将群体分解为多个亚簇
鸟嘌呤+MPA：k=3可以合理地分辨出包含166、77、25个细胞细胞的3个亚簇

根据对四种处理条件的分析得到的SC3聚类结果对细胞进行重新标记，可以看到不同绘图方案下的8个不同的亚聚类

三维PCA图：8个子簇的分布(D.1 n = 177,D.2n=56，G.1n=135，G.2n=123，M.1n=85，MG.1n=166，MG.2n=77，MG.3=n25细胞)。

将合并后的4个样本的数据进行SC3聚类分析(k=8)，我们发现很大一部分细胞可以一致地映射到各样本的单个亚簇

桑基图：说明每个处理组中细分到的亚群，可以映射到8个SC3群

3.2.2 识别不同治疗条件和集群之间的差异表达基因

鉴定差异表达基因的方法：Wilcoxon检验（表达细胞占比>50%；平均对数变化绝对值>0.5）
以下热图可以很好地表示各样本不同cluster中的差异表达基因。

SC3鉴定的8个亚群对应的差异基因表达的热图：颜色代表细胞在对应基因的标准化表达水平（黄色：表达水平高）

作者同时以气泡图的形式展示4种不同聚类的差异表达基因

气泡图：SC3用k=4鉴定的聚类的一组差异表达基因。点的大小表示样本中表达相应基因的细胞百分比（直径越大，细胞占比越高），颜色表示样本中所有细胞中对应基因的标准化表达水平（颜色越深，基因表达越高）

挑选排名前4的差异表达基因作图如下：

箱线图显示SC3簇1中前4的差异表达基因 箱线图显示SC3簇2中前4的差异表达基因 箱线图显示SC3簇3中前4的差异表达基因 箱线图显示SC3簇4中前4的差异表达基因

3.2.3 在mpa处理的细胞中，选定的差异表达基因和生物学过程的分析

• 细胞通过上调RNA pol II的活性来生成更多的成熟rRNA：以应对细胞内rRNA的缺乏，因为在MPA处理的细胞中，参与rRNA预处理的蛋白的mRNA表达上调(GAR1、UTP14、CGR1、DBP3和PXR1)。然而，已知MPA通过降低RNA pol I和RNA pol III的活性来降低核糖体的生物合成和rRNA的水平。这种rRNA的减少导致细胞内核糖体蛋白的积累。
• 细胞通过上调RNA pol II的活性来生成更多的成熟tRNA：tRNA合成酶和tRNA甲基转移酶基因(TRM1、SES1、ABP140、THS1、VAS1)也有表达上调，已知MPA通过降低RNA pol I和RNA pol III的活性来降低tRNA的水平.
• MPA通过制造更密集的染色质结构来抑制转录：MPA是一种转录延伸抑制因子，气泡图可以看到组蛋白和核小体组装基因(FPR4、FPR3)在MPA细胞中表达上调。而FPR3和FPR4与rDNA有关，rDNA的复制和重组与18岁的衰老有关。
• MPA对翻译过程有整体影响：MPA处理的细胞通过增加翻译起始来挽救蛋白质产量减少的表型，因此翻译起始因子基因表达上调，包括TIF3、GCD11、TIF4631、FUN12和GCD2。（之前有报道称MPA处理会导致鸟苷核苷酸的减少，蛋白质产量减少(rRNA和mRNA表达减少)，细胞会试图通过增加翻译起始来挽救这种表型）。同时，MPA处理的细胞参与组蛋白乙酰化、翻译起始和延伸的SAGA复合物的一些成分也受到了影响。
• MPA的抗氧化机理：MPA处理使的细胞中抗氧化基因TSA1和TRR1表达上调，如此一来保护细胞免受氧化损伤。这种抗氧化作用之前也在小鼠模型中报道过。
• MPA处理增加了细胞蛋白质负荷：MPA处理的细胞表现出伴侣蛋白（STI1, SSE1）的表达上调
• MPA处理影响核糖体蛋白在细胞内的积累：参与核糖体成分转运的基因表达上调（NUG1、NOC2和RRS1），同时用MPA处理的细胞也表现出40S和60S核糖体亚基表达的改变。部分亚基成分表达下调(RPL41A、RPL41B和RPS29B)，而其他亚基成分表达上调(RPL18A)。细胞中形成核糖体不同亚基的r蛋白之间存在着微妙的平衡，有人认为，在核糖体应激期间，可能会有未在核糖体中组装的游离r蛋白积累。
• MPA处理使线粒体功能下降：MPA处理的细胞中，与线粒体功能相关基因（MPC2，DPI8）表达下调。据了解，MPA处理对线粒体膜电位和线粒体组成有影响，因此MPA处理后这些基因的下调，可能表明线粒体功能下降，并不令人惊讶。
  气泡图：4个样本(Dn=233、Gn=258、Mn=85、MGn=268细胞)中鉴定的关键差异表达基因。点的大小表示样本中表达相应基因的细胞百分比（直径越大，细胞占比越高），颜色表示样本中所有细胞中对应基因的标准化表达水平（颜色越深，基因表达越高）
  对MPA处理组的GO富集通路分析：
• 有一个ncRNA代谢过程的上调，涉及蛋白质翻译过程中的tRNA氨基酰化，以及蛋白酶体组件 & 核糖体组装的相关细胞成分通路的上调，如氨基酸激活、肽生物合成过程，翻译起始等。
• 存在细胞组成相关基因的下调，涉及核糖体RNA 转运，核糖体组装和核糖体RNA代谢过程
• 线粒体的功能也表现为丙酮酸代谢过程的下调。
• 磷脂酰肌醇介导的信号转导在MPA处理的细胞中被下调。
• 细胞壁组织的调控也被下调
• 单羧酸代谢过程的下调