使用clusterProfiler进行GO富集分析
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clusterProfiler是一个功能强大的R包，同时支持GO和KEGG的富集分析，而且可视化功能非常的优秀，本章主要介绍利用这个R包来进行Gene Ontology的富集分析。
进行GO分析时，需要考虑的一个基础因素就是基因的GO注释信息从何处获取。Bioconductor上提供了以下19个物种的Org类型的包，包含了这些物种的GO注释信息
| packages | organism |
|---|---|
| org.Ag.eg.db | Anopheles |
| org.At.tair.db | Arabidopsis |
| org.Bt.eg.db | Bovine |
| org.Ce.eg.db | Worm |
| org.Cf.eg.db | Canine |
| org.Dm.eg.db | Fly |
| org.Dr.eg.db | Zebrafish |
| org.EcK12.eg.db | E coli strain K12 |
| org.EcSakai.eg.db | E coli strain Sakai |
| org.Gg.eg.db | Chicken |
| org.Hs.eg.db | Human |
| org.Mm.eg.db | Mouse |
| org.Mmu.eg.db | Rhesus |
| org.Pf.plasmo.db | Malaria |
| org.Pt.eg.db | Chimp |
| org.Rn.eg.db | Rat |
| org.Sc.sgd.db | Yeast |
| org.Ss.eg.db | Pig |
| org.Xl.eg.db | Xenopus |
clusterProfiler在做GO分析时，会读取这些包中的GO信息，从这里也可以看出，Bioconductor的生态体系，不同R包的数据传递和依赖组成了其生态环境。
对于以上19个物种，只需要安装对应的org包，clusterProfile就会自动从中获取GO注释信息，我们只需要差异基因的列表就可以了，使用起来非常方便。
在进行富集分析时，支持以下两种算法
1. Over-Representation Analysis
过表达分析其实就是费舍尔精确检验，对于以上19个物种，分析的代码如下
ego <- enrichGO(
gene = gene,
keyType = "ENTREZID",
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "CC",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.01,
qvalueCutoff = 0.05,
readable = TRUE)gene就是差异基因对应的向量，keyType指定基因ID的类型，默认为ENTREZID, 该参数的取值可以参考keytypes(org.Hs.eg.db)的结果， 建议采用ENTREZID, OrgDb指定该物种对应的org包的名字，ont代表GO的3大类别，BP, CC, MF; pAdjustMethod指定多重假设检验矫正的方法，cufoff指定对应的阈值，readable=TRUE代表将基因ID转换为gene symbol。
2. Gene Set Enrichment Analysis
ego <- gseGO(
geneList = geneList,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
ont = "CC",
nPerm = 1000,
minGSSize = 100,
maxGSSize = 500,
pvalueCutoff = 0.05,
verbose = FALSE)GSEA分析通过置换检验来计算p值，nPerm指定置换次数。
对于这19个物种之外的其他物种，也支持读取基因的GO注释文件，然后进行分析，注释文件的格式如下
| GeneId | GO | Description |
|---|---|---|
| 1 | GO:0005819 | spindle |
| 2 | GO:0072686 | mitotic spindle |
| 3 | GO:0000776 | kinetochore |
只需要3列信息即可，第一列为geneID, 第二列为基因对应的GO编号，第三列为GO的描述信息。这3列的顺序是无所谓的， 只要包含这3种信息就可以了。
读取该文件，进行分析的代码如下
data <- read.table(
"go_annotation.txt",
header = T,
sep = "\t")
go2gene <- data[, c(2, 1)]
go2name <- data[, c(2, 3)]
# 费舍尔精确检验
x <- enricher(
gene,
TERM2GENE = go2gene,
TERM2NAME = go2name)
# GSEA富集分析
x <- GSEA(
gene,
TERM2GENE = go2gene,
TERM2NAME = go2name)对于GO富集分析的结果，clusterProfiler提供了以下几种可视化策略
1. barplot
用散点图展示富集到的GO terms,用法如下
barplot(ego, showCategory = 10)生成的图片如下
横轴为该GO term下的差异基因个数，纵轴为富集到的GO Terms的描述信息， showCategory指定展示的GO Terms的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。注意的颜色对应p.adjust值，从小到大，对应蓝色到红色。
2. dotplot
用散点图展示富集到的GO terms,用法如下
dotplot(ego, showCategory = 10)生成的图片如下
横轴为GeneRatio, 代表该GO term下的差异基因个数占差异基因总数的比例，纵轴为富集到的GO Terms的描述信息， showCategory指定展示的GO Terms的个数，默认展示显著富集的top10个，即p.adjust最小的10个。
图中点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色，大小对应该GO terms下的差异基因个数，个数越多，点越大。
3. GO有向无环图
调用topGO来实现GO有向无环图的绘制，代码如下
plotGOgraph(ego)生成的图片如下
矩形代表富集到的top10个GO terms, 颜色从黄色过滤到红色，对应p值从大到小。
4. goplot
和plotGOgraph展示的信息一样，都是GO有向无环图，只不过采用了igraph中的布局方式，用法如下
goplot(ego)生成的图片如下
5. emapplot
对于富集到的GO terms之间的基因重叠关系进行展示，如果两个GO terms系的差异基因存在重叠，说明这两个节点存在overlap关系，在图中用线条连接起来，用法如下
emapplot(ego, showCategory = 30)生成的图片如下
每个节点是一个富集到的GO term, 默认画top30个富集到的GO terms, 节点大小对应该GO terms下富集到的差异基因个数，节点的颜色对应p.adjust的值，从小到大，对应蓝色到红色。
6. cnetplot
对于基因和富集的GO terms之间的对应关系进行展示，如果一个基因位于一个GO Terms下，则将该基因与GO连线，用法如下
cnetplot(ego, showCategory = 5)生成的图片如下
图中灰色的点代表基因，黄色的点代表富集到的GO terms, 默认画top5富集到的GO terms, GO 节点的大小对应富集到的基因个数。
更多用法和细节请参考官方文档。
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